干扰素-λ对肥大细胞Toll样受体表达和细胞因子分泌的调节作用的研究

兰亚明，何韶衡

（1.湖北民族学院附属民大医院急诊科，湖北恩施445000；2.南京医科大学临床医学系，江苏南京210029）

干扰素-λ对肥大细胞Toll样受体表达和细胞因子分泌的调节作用的研究

兰亚明1，何韶衡2

（1.湖北民族学院附属民大医院急诊科，湖北恩施445000；2.南京医科大学临床医学系，江苏南京210029）

目的探究干扰素-λ（interferon-λ，INF-λ）对肥大细胞Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）表达和细胞因子分泌的调节作用。方法采用干扰素-λ激发肥大细胞P815，收集激发后2、6、16 h不同时间点的细胞及其上清液。采用MTT方法检测不同时间点干扰素-λ对肥大细胞P815的细胞活力的影响；采用酶联免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测细胞因子IL-4和IL-13的释放量；通过Western blot方法检测干扰素-λ对肥大细胞Toll样受体TLR2和TLR4蛋白表达的影响。结果MTT实验结果表明，不同时间的干扰素-λ对肥大细胞P815的细胞活力均无显著性差异；ELISA结果表明，干扰素-λ能刺激肥大细胞P815释放IL-4和IL-13细胞因子，并且其释放量与空白对照组具有显著性差异（P＜0.01）；Western blot实验表明，与空白对照组相比，干扰素-λ激发肥大细胞P815后，不同时间点的给药组均可上调TLR2和TLR4蛋白的表达。当给药时间为16h时，其TLR2和TLR4蛋白的表达具有显著性上调（P＜0.01）。结论干扰素-λ刺激肥大细胞P815释放IL-4和IL-13细胞因子可能是通过上调Toll样受体TLR2和TLR4蛋白的表达。

干扰素-λ；肥大细胞；Toll样受体；细胞因子

以往有关干扰素-λ的研究主要集中在其抗病毒和抗肿瘤方面［1-3］。由于干扰素-λ的蛋白质结构与白介素（IL）家族成员相似，所以现在越来越多的研究也集中在干扰素-λ与过敏性炎症反应的发生和发展中［4-5］。Consol M等［6］发现肥大细胞表达的干扰素-λ与过敏性哮喘的发生有关。特异性过敏原通过诱导CD4＋细胞释放IL-4诱导干扰素-λ的释放。此外，临床研究也表明，干扰素-λ可通过调节细胞因子分泌，进而诱导炎症性细胞的趋化作用［7-8］。

肥大细胞是过敏原引发过敏性炎症反应的主要细胞之一，其主要的过敏反应为肥大细胞脱颗粒反应。在初级效应阶段，肥大细胞被过敏原激活后进而促进其细胞内过敏性介质的合成和释放，发挥其生物学效应［9］。相关研究表明，过敏原刺激后可诱导白细胞释放IL-13和IL-4。然而，干扰素-λ能否刺激肥大细胞释放IL-13和IL-4细胞因子？其可能的信号介导途径又是如何？因此，本文旨在探究干扰素-λ能否刺激肥大细胞IL-13和IL-4细胞因子的释放及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与试剂：注射用干扰素-λ（安耐吉化学，批号：20130705），DMEM／F-12培养基（HyClone公司，批号：NYE0874），DMEM培养基（低糖）（HyClone公司，批号：NYA0798），胎牛血清（HyClone公司，批号：NVM0877），鼠抗β-actin、鼠抗TLR2抗体、鼠抗TLR4抗体（Santa Cruz，批号：＃L0710）；辣根酶标记山羊抗鼠IgG（中山金桥，批号：107015）；IL-4、TL-13 ELISA试剂盒（美国Biosource公司）。

1.1.2 主要仪器：ELX800UV酶标仪（Bio-TEK公司）；CK2型倒置显微镜（日本Olympus公司）；光学显微镜（DP70，日本Olympus公司）；转移电泳槽：DYY-III408（北京六一仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：将P851细胞接种于培养瓶中，培养基为DMEM（含10%胎牛血清、青霉素100 U／mL和链霉素100μg／mL），置于37℃、5%CO2培养箱，相对饱和湿度的条件下培养。细胞呈单纯贴壁生长，隔日换液，待细胞长至90%的密度，用0.25%胰蛋白酶消化传代，每3～5 d传代1次。

1.2.2 细胞激发：激发实验之前，先将P815细胞至于无血清的DMEM中培养7 h，取处于对数生长期的P8125细胞，种至6孔培养板中，培养24 h待细胞贴壁后，再将其置于无血清的DMEM中培养7 h，给药组同时加入干扰素-λ（100 ng／mL），分别作用2、6、16 h。激发结束后，收集每组细胞上清液用于ELISA检测，细胞用于提蛋白进行Western blot检测TLR2和TLR4蛋白表达。

1.2.3 MTT法检测干扰素-λ对细胞活力的影响：取对数生长期的肥大细胞P815配成（1×105个／m L）的混悬液接种于96孔板中，每组加入干扰素-λ（100 ng／mL）分别作用2、6、16 h。空白对照组加入相同体积的培养液。作用结束后，每孔加入终浓度为5mg／mL的20μLMTT溶液放置于培养箱中孵育4 h，除去孔内培养上清液，每孔加入150μL二甲基亚枫（dimethyl sulfoxide，DMSO），振荡10 min，采用酶标仪测定各孔吸光度（absorbance，OD）值，计算细胞活力。

1.2.4 ELISA法检测IL-4和IL-13释放水平：给药组中加入干扰素-λ（100ng／mL）培养液1 mL／孔，于37℃、5%CO2细胞培养箱中分别培养2、6、16 h。另设单加空白培养基组作为空白对照组。采用ELISA法，分别取细胞上清液40μL检测IL-4和IL-13释放量。根据说明书具体操作。

1.2.5 Western blot检测TLR2和TLR4蛋白的表达：不同时间点处理后，收集细胞，每组加入含1%PMSF的蛋白裂解液，冰上裂解30min后，4℃15000 r／min离心30min，取上清液。采用BCA法测定蛋白浓度，每组给予20μg的蛋白上样量，SDSPAGE凝胶电泳，NC膜湿转，5%脱脂奶粉封闭2 h，TLR2、TLR4（mousemonoclonal IgG，1∶1000）4℃孵育过夜，PBST（含0.1% Tween 20的PBS）洗3次，每次10min。加入对应的二抗室温孵育1.5 h，PBST洗3次，每次10min。采用化学发光方法显影，定影，经Adobe Photoshop 6.0（Adobe Systems，San Jose，CA）分析蛋白表达。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，实验正态计量数据以±s”表示。多组间均数比较采用单因素方差分析，2组间均数比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 干扰素-λ对P815细胞活力的影响 本次结果表明，与对照组相比，不同时间点的干扰素-λ均对P815细胞的损伤无明显影响。此结果表明，干扰素-λ（100 ng／mL）对小胶质细胞的影响与其调节细胞活力无关。并且此条件下，细胞形态未发生明显改变，细胞存活率结果（见图1）。

图1 不同时间点的干扰素-λ对P815细胞活力的影响1.对照组；2.2 h干扰素-λ给药组；3.6h干扰素-λ给药组；4.16 h干扰素-λ给药组Fig.1 Effect of IFN-λat different times on the cell viability of P8151.Control group；2.2 h IFN-λtreatment group；3.6h IFN-λ treatment group；4.16h IFN-λtreatment group

2.2 干扰素-λ激发P815细胞后对IL-4及IL-13表达水平的影响 干扰素-λ激发P815细胞后，可刺激P815细胞释放细胞因子IL-4及IL-13。相对于对照组，不同时间点的激发给药组其IL-4及IL-13分泌水平均明显上升（P＜0.05，P＜0.01），并且显示出明显的时效关系（见表1）。

表1 干扰素-λ激发P815细胞后IL-4及IL-13表达水平的影响（pg／mL）Tab.1 The effect of IFN-λon the secretion of IL-4 and IL-13 in P815（pg／mL）

2.3 干扰素-λ激发P815细胞后对TLR2蛋白表达水平的影响 实验结果显示，与空白对照组相比，干扰素-λ激发P815细胞2、6、16 h后TLR2蛋白的表达均有显著性的上调。结果显示，干扰素-λ对肥大细胞释放细胞因子与Toll样受体TLR2表达有关（见图2）。

图2 干扰素-λ对TLR2蛋白表达水平的影响1.对照组；2.2 h干扰素-λ给药组；3.6h干扰素-λ给药组；4.16 h干扰素-λ给药组*P＜0.05，**P＜0.01，与对照组相比Fig.2 Effect of IFN-λon the expression of TLR21.Control group；2.2h IFN-λtreatment group；3.6h IFN-λ treatment group；4.16h IFN-λtreatment group *P＜0.05，**P＜0.01，compared with control group

2.4 干扰素-λ激发P815细胞后对TLR4蛋白表达水平的影响 实验结果显示，与空白对照组相比，干扰素-λ激发P815细胞2、6、16 h后TLR4蛋白的表达均有显著性的上调。结果显示，干扰素-λ对肥大细胞释放细胞因子与Toll样受体TLR4表达有关（见图3）。

图3 干扰素-λ对TLR4蛋白表达水平的影响1.对照组；2.2 h干扰素-λ给药组；3.6h干扰素-λ给药组；4.16 h干扰素-λ给药组*P＜0.05，**P＜0.01，与对照组相比Fig.3 Effect of IFN-λon the expression of TLR41.Control group；2.2 h IFN-λtreatment group；3.6 h IFN-λ treatment group；4.16 h IFN-λtreatment group *P＜0.05，**P＜0.01，compared with control group

3 讨论

由于肥大细胞在天然免疫早期调节中发挥着极为重要的作用，如调控细胞因子、趋化因子、脱颗粒的产生［10］。肥大细胞是过敏性疾病反应中重要的效应细胞，被公认为哮喘效应阶段的核心调节细胞。肥大细胞的调节免疫反应主要是通过分泌大量细胞因子和趋化因子，进一步促进炎症的发生，引起各种临床过敏症状，从而在过敏性疾病中起重要作用。因此，相关的研究主要集中在肥大细胞的过敏反应中。以往研究表明，过敏原（细菌、病毒或其产物）都可激活肥大细胞，进而诱发肥大细胞释放介质发挥宿主防御效应。

本次实验首先检测不同时间点（2、6、16 h）干扰素-λ（100 ng／mL）对肥大细胞P815细胞活力的影响。实验结果表明，与对照组相比，不同时间点的干扰素-λ对P815的细胞活力的影响均无显著性差异。此结果显示，干扰素-λ对肥大细胞P815的调节作用与细胞活力无关。因此，本文继续探究其可能的炎症调节作用。

IL-4、IL-13是由巨噬细胞、T细胞、B细胞等多种细胞诱发产生的，在调节细胞的免疫应答中发挥着重要作用［11］。以往研究发现，在过敏原刺激后哮喘患者的上皮细胞释放的IL-4和IL-13会明显升高，因此，IL-4、IL-13和其他细胞因子在过敏反应中发挥着极为重要的调控作用。本次研究表明，干扰素-λ可激发肥大细胞P815释放细胞因子IL-4和IL-13，该结果显示，干扰素-λ发挥其免疫应答调控的机制可能与其调节细胞因子IL-4和IL-13的表达释放有关。

Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）是可识别病原相关分子模型的识别受体（pathogen associated molecule patterns，PMAPs）。肥大细胞是重要的免疫调节细胞之一，因此有关肥大细胞TLRs受体表达和功能的研究引起了越来越多的关注，相关研究表明Toll样受体在不同的组织和细胞中分布不同，以往研究表明肥大细胞表达TLR2和TLR4［12-15］。因此，本文主要观察肥大细胞P815中TLR2和TLR4蛋白表达水平的变化。本次研究表明，干扰素-λ激活P815后，可上调Toll样受体TLR2和TLR4蛋白的表达。此次结果提示，干扰素-λ可能是通过上调TLR2和TLR4蛋白表达，进而激活P815释放炎症细胞因子IL-4和IL-13，此结果进一步扩充了干扰素-λ在炎症反应中可能的作用机制。

综上所述，干扰素-λ可能通过调控Toll样受体TLR2和TLR4蛋白的表达，进而诱发炎症细胞因子的释放。此次结果可能说明干扰素-λ在对抗细菌病原体的免疫调节作用机制，为研究肥大细胞的相关分子机制提供了更多的理论依据。

［1］Donoho DL，Gavish M，Montanari A.The phase transition of matrix recovery from Gaussian measurements matches the minimax MSE of matrix denoising［J］.Proc Natl Acad SciU SA，2013，110（21）：8405-8410.

［2］Nie YJ，Huang XY，Wang SH.Effect of IFN-λ2 on apoptotic protein in themyocardium inmice with viralmyocarditis［J］.Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi，2009，11（4）：296-300.

［3］Morrison MH，Keane C，Quinn LM，et al.IFNL cytokines do not modulate human ormurine NK cell functions［J］.HepatMon，2014，14（6）：178-183.

［4］KeshvariM，Sharafi H.Interferon-λGenetic Variationsand Hepatitis C：Yet to be Discovered［J］.Hepat Mon，2014，14（5）：194-200.

［5］Freeman J，Baglino S，Friborg J，et al.Pegylated interferons Lambda-1a and alfa-2a display differentgene induction and cytokine and chemokine release profiles in whole blood，human hepatocytes and peripheral blood mononuclear cells［J］.JViral Hepat，2014，21（6）：1-9.

［6］Galmozzi E，ViganòM，Lampertico P.Letter：do interferonλ3 polymorphisms predict the outcome of interferon therapy in hepatitis B infection？Authors′reply［J］.Aliment Pharmacol Ther，2014，39（10）：1251-1252.

［7］Sheahan T，Imanaka N，Marukian S，et al.Interferonλalleles predict innate antiviral immune responses and hepatitis C virus permissiveness［J］.Cell Host Microbe，2014，15（2）：190-202.

［8］Mancuso ME，Linari S，Aghemo A，et al.Interferonλ3 rs12979860 polymorphism in patients with haemophilia and HCV infection：a predictor of spontaneous viral clearance and sustained virological response［J］.Thromb Haemost，2014，111（6）：1067-1076.

［9］Rahir G，Wathelet N，Hanoteau A，et al.Cyclophosphamide treatment induces rejection of established P815 mastocytoma by enhancing CD4 priming and intratumoral infiltration of P1E／H-2K（d）-specific CD8＋T cells［J］.Int JCancer，2013，134（12）：2841-2852.

［10］Tilaoui M，Mouse HA，Jaafari A，et al.Differential Effect of Artemisinin Against Cancer Cell Lines［J］.Nat Prod Bioprospect，2014，4（9）：189-196.

［11］Zhang G，Khoo SK，MäkeläMJ，et al.Maternal Genetic Variants of IL4／IL13 Pathway Genes on IgEWith＂Western or Eastern Environments／Lifestyles＂［J］.Allergy Asthma Immunol Res，2014，6（4）：350-356.

［12］杨海伟，魏继福，何韵衡.肥大细胞Toll样受体的研究进展［J］.细胞与分子免疫学杂志，2008，24（9）：933-934.

［13］Phongsisay V，Iizasa E，Hara H，et al.LMIR5 extracellular domain activatesmyeloid cells through Toll-like receptor 4［J］.Mol Immunol，2014，62（1）：169-177.

［14］Debińska A，Boznański A.The role of Toll-like receptors in the pathogenesis of allergic diseases—where is the truth？［J］.Postepy Hig Med Dosw，2014，68（10）：230-237.

［15］Zhao BG，Vasilakos JP，Tross D，etal.Combination therapy targeting toll like receptors 7，8 and 9 eliminates large established tumors［J］.J Immunother Cancer，2014，2（6）：12-14.

（编校：吴茜，刘路路）

Study on regulatory role of interferon-λfor mast cell toll-like receptor expression and cytokine secretion

LAN Ya-ming1，HE Shao-heng2

（1.Department of Emergency，Affiliated Hospital of Hubei Institute for Nationalities，Enshi445000，China；2.Department of Clinical Medicine，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

ObjectiveTo explore the interferon-λ（interferon-λ，INF-λ）of themast cell Toll-like receptors（TLRs）regulation of expression and cytokine secretion.MethodsInterferon-λstimulatedmast cells P815，after2，6，16h，cells and supernatantswere collected at different time points.Using MTTmethod at different time points to detect interferon-λimpact on cell viability ofmast cells P815；using ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）to detect cytokines IL-4 and IL-13 emission；through Western blotmethod for detecting expression of interferon-λToll-like receptors on mast cells TLR2 and TLR4 protein.ResultsMTT results showed that at different times，interferon-λ's impact on mast cells P815 viability showed no significant difference；ELISA results showed that interferon-λ's impact on mast cells P815 could stimulate the release of IL-4 and IL-13 cytokines，and its release compared with the control group had significant difference（P＜0.01）；Western blot experiments showed that，compared with the control group，after interferon-λstimulatemast cells P815，administration group atdifferent time points could raise expression of TLR2 and TLR4 protein.When the delivery time was 16 h，TLR2 and TLR4 protein expression significantly increased（P＜0.01）.Conclusion Mast cells stimulated by IFN-λrelease P815 IL-4 and IL-13 cytokinesmay be regulated by the expression of Toll-like receptors TLR2 and TLR4 protein.

interferon-λ；mast cells；Toll-like receptor；cytokines

R735.1

A

1005－1678（2014）08－0012－04

国家自然科学基金（81030054）

兰亚明，男，本科，主治医师，研究方向：急诊急救，E-mail：qch1821460036＠163.com。