响应面法优化沙棘提取工艺研究

游广辉，董娟，王丽娟

（1.郑州人民医院药学部，河南郑州450000；2.郑州第一人民医院药剂科，河南郑州450004；3.郑州大学医学院药学院，河南郑州450000）

响应面法优化沙棘提取工艺研究

游广辉1，董娟2，王丽娟3

（1.郑州人民医院药学部，河南郑州450000；2.郑州第一人民医院药剂科，河南郑州450004；3.郑州大学医学院药学院，河南郑州450000）

目的以芦丁提取量为响应值，优化沙棘的提取工艺。方法采用加热回流法，结合单因素试验和响应面分析法，选取回流时间、乙醇浓度、溶剂倍量3个因素，对沙棘的提取工艺进行优化考察。结果沙棘的最佳提取条件为：回流时间为70min，乙醇浓度为60%，溶剂倍量为12，在此提取条件下平均提取量为（0.268±0.005）mg／g。结论采用本实验方法优化沙棘的提取工艺，具有可行性。

沙棘；提取；芦丁；响应面法

沙棘为胡颓子科植物沙棘Hippophae rhamnoides L.的干燥成熟果实。系蒙古族、藏族习用药材［1］。具有健脾消食，止咳祛痰，活血散瘀功效。用于脾虚食少，食积腹痛，咳嗽痰多，胸痹心痛，瘀血经闭，跌扑瘀肿等症［2］。沙棘是药食兼用的功能植物，果实中含有脂肪酸、类胡萝卜素、植物甾醇、黄酮醇苷、原花青素等多种活性物质，并具有解重金属毒、放射保护、抗氧化应激、抗肿瘤、抗炎、抗溃疡、调节免疫等多种药理作用［3］。本实验采用响应面法拟合数据模型，优化沙棘的提取工艺，为进一步制备沙棘新制剂提供参考［4］。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 PS-20型超声波清洗器（深圳市科洁超声科技有限公司）；DZKW-C型电子恒温水浴锅（郑州长城科工贸有限公司）；SHB-3型循环水多用真空泵（郑州杜甫仪器厂）；WFZ UV-2102 PCS型紫外可见分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司）；

芦丁对照品（购自中国药品生物鉴定所）；沙棘药材（购自成都市荷花池中药材市场）经郑州大学药学院张振中教授鉴定为合格药材；超纯水自制；试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 含量测定方法的建立

①对照品溶液的制备：精密称取芦丁对照品适量，加60%乙醇，水浴微热使溶解，制得含量为0.5mg／mL的对照品溶液。

②测定波长的选择［5］：采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法。取对照品溶液2 mL于25 m L量瓶中，加60%乙醇至5mL，加5%亚硝酸钠溶液1mL，混匀，放置6min，再加1M 10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min。再加氢氧化钠试液10mL，加60%乙醇至刻度，摇匀，放置15min，以60%乙醇为空白，于波长400～600 nm范围内扫描，508 nm波长处有一最大吸收峰，故选择508 nm为测定波长。

③标准曲线的绘制：精密量取对照品溶液1、2、3、4、5、6mL，分别置于25mL量瓶中，按1.2.1项下方法于波长508 nm下测定其吸光度，用60%乙醇作参比，以吸光度A对浓度C作线性回归。

④供试品溶液的制备：将沙棘药材，去杂质，置于烘箱中60℃干燥6 h，粉碎过筛。各取10 g，精密称定，回流温度为80℃，将不同回流法的提取液浓缩，用提取时相应浓度的提取溶液定容至25 mL，精密吸取1 mL，用乙醇稀释至10 mL，摇匀备用。

1.2.2 单因素考察［6］

①考察回流时间对芦丁提取量的影响：精密称取沙棘各10 g，固定溶剂倍量为8，乙醇浓度40%，以回流时间40、50、60、70、80min进行提取，考察回流时间对芦丁提取量的影响。

②考察乙醇浓度对芦丁提取量的影响：精密称取沙棘各10 g，固定溶剂倍量为8，按照最佳回流时间，分别用40%、50%、60%、70%、80%的乙醇作为提取溶剂，考察乙醇浓度对芦丁提取量的影响。

③考察溶剂倍量对芦丁提取量的影响：精密称取沙棘各10 g，按照最佳乙醇浓度及回流时间，以溶剂倍量6、8、10、12、14进行提取。

1.2.3 响应面法优化提取工艺［7-8］：在单因素实验的基础上，以芦丁的提取量为指标，选择对沙棘提取效果影响较显著的3个因素作为考察指标，即回流时间（A），乙醇浓度（B），溶剂倍量（C），采用三因素三水平的Box-Behnken响应面法优化提取工艺［9］（见表1）。

表1 各因素水平的代码值及实际物理量Tab.1 Code value of each factor level and actual quantity

2 结果

2.1 标准曲线 以吸光度A对浓度C作线性回归得到：A＝12.899C－0.8932（r＝0.9995），结果显示芦丁在0.02～0.12mg／mL内具有良好线性关系。

2.2 单因素考察结果

2.2.1 回流时间对芦丁提取量的影响 由图1可知，沙棘中芦丁的提取量随着回流时间的增加而升高，当回流时间为70min时，芦丁的提取量取得较大值，此后随着时间的延长，提取量反而降低，可能是因为芦丁的溶出已较为完全，而回流时间的增加，导致其他杂质溶出增加，相对减少了芦丁的溶出，故选择70min为最佳提取时间。

图1 回流时间对芦丁提取量的影响Fig.1 Effect of reflux extraction time on rutin extraction amount

2.2.2 乙醇浓度对芦丁提取量的影响 由图2可知，随着乙醇浓度的升高，沙棘中芦丁的提取量逐渐增大，当乙醇浓度达到60%时，芦丁的提取量达到最大值，之后随着乙醇浓度的增加，芦丁含量反而下降，其原因可能是芦丁是极性高的黄酮类化合物，且乙醇浓度过高，增加了醇溶性杂质及色素等的溶出，故60%为乙醇最佳提取浓度。

图2 乙醇浓度对芦丁提取量的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on rutin extracts

2.2.3 溶剂倍量对芦丁提取量的影响 由图3可知，随着溶剂倍量的增加，芦丁的提取量上升到一定程度后，增加量反而降低，这可能是随着溶剂体积的增大，其他可溶性杂质的溶解度逐渐增大，进而导致芦丁的提取量减少，故选定12为溶剂倍量。

图3 溶剂倍量对芦丁提取量的影响Fig.3 Effect of extracting solvent times on rutin extracts

2.3 响应面法优化提取结果 响应面法优化提取工艺结果，见表2、表3。

表2 沙棘Box-Behnken中心组合实验设计与结果Tab.2 Experimental design and results of seabuckthorn Box-Behnken center combination

表3 回归系数显著性分析Tab.3 Significance analysis of regression coefficient

采用Design-Expert8.0.6软件对实验数据进行二次回归拟合，以芦丁含量对数据进行拟合得到回归方程：Y＝0.27-0.00625A＋0.010B＋0.016C＋0.015AB＋0.018AC＋0.015BC＋0.00625A2-0.026B2-0.024C2，P＝0.0160＜0.01；根据回归方程可得，二次多项式拟合结果较好。方程回归分析及方差分析结果见表3，并根据二次回归方程绘制响应面曲线，能得到2个因素交互作用对响应值Y的影响，结果见图4。

图4 两因素交互作用对芦丁提取量影响的响应图Fig.4 Response figure of two factor interactions on rutin extracts

由图4可知，各因素对芦丁提取量的影响由大到小依次为：溶剂倍量C＞乙醇浓度B＞回流时间A；在3个因素中，溶剂倍量及乙醇浓度之间的交互作用对响应面的影响曲线较陡，等高线的数目也多于其他两两之间的交互作用，故乙醇浓度和溶剂倍量对芦丁的提取量具有非常显著的影响（P＜0.01）。

2.4 最佳处方的验证 采用Design-Expert V8.0.6软件分析数据，得到沙棘中芦丁提取的理论最佳工艺条件为：回流时间为70.59min，乙醇浓度为61.03%，溶剂倍量为12.21。在此条件下预测芦丁的提取量为0.276 mg／g。考虑实验具体操作性，按回流时间70min，乙醇浓度60%，溶剂倍量12，对沙棘进行3次平行验证试验，测得芦丁的平均提取量为（0.268±0.005）mg／g。结果表明，试验优化的提取工艺参数准确可靠，具有实际应用价值。

3 讨论

沙棘为蒙古族、藏族习用药材。在免疫系统、抗肿瘤、心血管系统、血液系统、消化系统、抗氧化、抗放射性、抗炎、抗过敏，以及对代谢影响等诸多方面均有作用［10］。同时，沙棘所含的维生素、黄酮类化合物、三萜及甾体类化合物、脂肪酸类、酚类、有机酸类、5-羟色胺、鞣质、微量元素、多糖等多种化学成分［11］。

参考相关文献［12］及中国药典，本文以黄酮类成分芦丁作为评价指标进行研究。通过单因素实验和响应面法相结合，考察了回流时间、乙醇浓度、溶剂倍量对芦丁的提取量的影响，优选沙棘的回流提取条件，结合实验具体操作得到最佳超声提取条件：回流时间为70min，乙醇浓度为60%，溶剂倍量为12，芦丁的提取量较好，为沙棘新制剂的制备相关研究提供参考。

［1］杨芳.沙棘的研究进展［J］.第一军医大学分校学报，2004，27（1）：79-81.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典［S］.二部.北京：中国医药科技出版社，2010：171-172.

［3］顾关云.沙棘的化学成分、生物活性与临床研究［J］.国外医药，2007，22（4）：139-148.

［4］黄元红，卫天喜，张发生，等.星点设计-效应面法优选丹参提取工艺［J］.中国实验方剂学杂志，2010，16（17）：28-31.

［5］赵玉琪，殷丽君.沙棘叶黄酮的提取及其对抗氧化性的影响［J］.食品工业科技，2006，27（4）：70-75.

［6］蔡恩博，张崇禧，朱启光，等.星点设计-效应面法优选暴马丁香树皮中紫丁香苷的提取工艺［J］.药物分析杂志，2011，31（9）：1808-1811.

［7］吴云娟，沙先谊，李珺婵，等.星点设计-效应面优化法优化三七总皂苷鼻腔用粉雾剂［J］.中成药，2005，27（1）：10-15.

［8］熊萍，张榕文，万玉华，等.超声-微波协同萃取法提取飞扬草中没食子酸的工艺研究［J］.中国现代中药，2011，13（6）：45-47.

［9］焦翔，殷丽君，程永强.沙棘叶黄酮的提取及抑菌作用研究［J］.食品科学，2007，28（8）：124-128.

［10］张绕，束梅英.沙棘药理研究进展［J］.沙棘，1999，12（3）：40-44.

［11］徐铭渔，孙小宣，童文新.沙棘的医药研究和开发［J］.沙棘，1994，7（1）：32-40.

［12］廉永善，万里.沙棘属植物生物活性物质种类及其主要生理药理功能［J］.沙棘，2007，20（3）：1-4.

（编校：王俨俨）

Study on optim izing extraction technics of Hippophae rhamnoides L.by response surfacemethodology

YOU Guang-hui1，DONG Juan2，WANG Li-juan3

（1.Department of Pharmacy，People's Hospital of Zhengzhou，Zhengzhou 450000，China；2.Department of Pharmacy，Zhengzhou First People's Hospital，Zhengzhou 450004，China；3.College of Pharmacy，Medical college of Zhengzhou University，Zhengzhou 450000，China）

ObjectiveTo optimize the extraction process of Hippophae rhamnoides L.with the content of rutin which is regarded as evaluation index.MethodsExtraction process of Hippophae rhamnoides L.was investigated and optimized based on the single factor experimentand response surface methodology with reflux extraction time，ethanol concentration，and solid-liquid ratio as three evaluation factors.ResultsThe results indicated that the optimal extraction processwas obtained as follows：12 times extracting solvent of60%ethanol under reflux extraction 70min；the average content of rutin was（0.268±0.005）mg／g.Conclusion Themethod to optimize the extraction process is reasonable.

Hippophae rhamnoides L.；extraction；rutin；response surfacemethodology

R283.6

A

1005－1678（2014）08－0180－03

国家自然科学基金项目（30973742）

游广辉，男，硕士，副主任医师，研究方向：临床药学，E-mail：youguanghui1212＠163.com。