STAT6-ORF表达载体的构建与鉴定

刘锦宙，杨燕，谢而付

（1.江西省宜春市人民医院消化内科，江西宜春336000；2.江西省宜春职业技术学院，江西宜春336000；3.南京医科大学医学科学部，江苏南京210029）

STAT6-ORF表达载体的构建与鉴定

刘锦宙1，杨燕2，谢而付3

（1.江西省宜春市人民医院消化内科，江西宜春336000；2.江西省宜春职业技术学院，江西宜春336000；3.南京医科大学医学科学部，江苏南京210029）

目的本文旨在构建STAT6-ORF表达载体，包装成慢病毒颗粒。方法应用嵌套PCR法从生长状态良好的293FT细胞的cDNA中扩增STAT6的完整读码框片段（2544 bp），根据需要在引物的5′端分别引入Cla I和Mlu I酶切位点，将PCR产物克隆到pMD20T载体上，得到pMD20T-STAT6-ORF克隆；测序验证后，用Cla I和Mlu I双酶切pMD20T-STAT6克隆，回收酶切产物得到的STAT6-ORF片段，通过T4 DNA连接酶连接到pLVTHm表达载体上，经双酶切和测序验证正确，获得pLVTHm-STAT6-ORF表达载体。结果构建带有增强绿色荧光蛋白EGFP（enhanced green fluorescence protein）标记的STAT6-ORF表达载体，包装成慢病毒颗粒，结果表明成功构建及包装带STAT6-ORF目的片段的慢病毒表达载体。结论pLVTHm-STAT6过表达载体构建成功，可以进行慢病毒包装与鉴定。

STAT6-ORF；慢病毒颗粒；增强绿色荧光蛋白

在免疫细胞中，STAT6在IL-4或IL-13的刺激下，通过JAK激酶（janus kinase，JAK）的作用，胞质中非磷酸化（失活状态）的STAT6蛋白被磷酸化（激活）后形成二聚体，进入细胞核内，识别核内特异的DNA结合元件并与之结合，启动下游特定基因的表达，产生相应的生物学效应，如IgE的产生，Th2细胞的分化及淋巴细胞的发育等［1-5］。但越来越多的研究表明，该信号与癌症的发生发展也密切相关［6-7］。长期慢性的炎症可以诱发癌症，但2者分子交叉机制目前仍不清楚［8-10］。推测可能与IL-4-STAT6信号所介导功能的转变密切相关［11］。本研究选择能够高效率感染目的细胞的慢病毒载体pLVTHm为骨架构建STAT6-ORF表达载体。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株、菌株和质粒：人胚肾HEK293FT细胞株，大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）DH5α均由南方医科大学基因工程研究所保存。

慢病毒载体pLVTHm由南方医科大学基因工程研究所提供，pLVTHm能表达EGFP，载体pMDTM20-T vector为日本TaKaRa公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 人胚肾HEK293FT细胞株的总RNA提取与纯化：TRIzol法提取RNA，异丙醇纯化RNA，按下列步骤操作：

细胞按1×106个／mL密度接种于6孔板培养，经处理后弃去上清，每孔加入1mL TRIzol（TAKARA公司产品），静置5min充分裂解（TRIzol变粘稠）后吸到1.5mLEP管中，或液氮速冻后－80℃保存备用。加200μL氯仿剧烈振荡，室温静置5 min，4℃，12000 g离心15min。将上清移到新EP管，加等体积（约500μL）异丙醇混匀，室温静置10min，4℃，12000 g离心10min。弃上清，500μL 75%乙醇洗涤；4℃，12000 g离心2 min，重复1次。空甩1次（常温12000 g离心1min）。超净台内把柱子盖打开吹1～2min，将柱子放到新的1.5mL EP管。加入10～40μL DEPC（依材料多少而稀释），62℃2 min，常温12000 g离心1min，管内即为RNA。取1μL用分光光度计（722S型，eppendorf公司，AG）检测纯度和浓度，1μL进行琼脂糖电泳（配制新鲜的1%琼脂糖凝胶，置换干净TAE缓冲液进行电泳）检测其完整性，余下部分立即保存于－80℃超低温冰箱中，或立即用于反转录反应。

1.2.2 反转录：根据PrimerScriptTMRT-PCR试剂盒步骤进行操作：在microtube中配制下列混合液：dNTP mixture（10 mM each），1μL；oligo dT primer（2.5μM），1μL；total RNA，100 pg～1μg；RNase free dH2O，10μL。RNA反应液离心，65℃，5min处理，迅速转到冰上冷却，离心数秒钟使模板RNA／引物等的混合液聚集于microtube管底部。在上述microtube管中配制下列反转录反应液：上述变性、退火反应液10μL；5×PrimeScript Buffer 4μL；PrimeScript RNase（for 2 Step）0.5μL；RNase inhibitor（40 U／μL）5μL；总体积20μL。在PCR仪上42℃（－50℃）15～30min进行反转录反应，之后70℃5 min进行反转录酶的失活反应，立即到冰上冷却，之后4℃保存。反应完毕后，取1μL cDNA用分光光度计（eppendorf公司，AG）检测纯度和浓度，并对其稀释至150 ng／μL，于－20℃保存备用。余下部分立即保存于－80℃超低温冰箱中。

1.2.3 扩增STAT6基因：以反转录所得的第一有义链cDNA为模板，根据序列保守区利用Primer5.0（PREMIER Biosoft International公司，USA）软件设计引物扩增STAT6基因，内参基因为GAPDH，引物均由上海Invitrogen公司合成。

1.2.4 STAT6基因与pMD20-T载体相连

①目的片段回收纯化：按凝胶回收试剂盒说明，进行操作。

②感受态细胞的制备：

受体菌的培养：从LB平板上挑取新鲜活化的E.coli DH5α取单菌落，接种于3～5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养12 h左右，直至对数生长后期。将此菌悬液以1∶50～1∶100的比例接种于100mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2～3 h，至OD600为0.5左右。

感受态细胞的制备（CaCl2法）：将上述细胞培养液转入离心管中，冰浴10min后，于4℃下3000 g离心10min；弃去上清液，用预冷的CaCl2溶液10 mL轻轻悬浮细胞，冰浴15 min，然后于4℃下3000 g离心10min；弃去上清液，加入4mL预冷CaCl2溶液（15%甘油，60mmol／L CaCl2），轻轻悬浮细胞，冰浴5min后，即制成感受态细胞悬液；无菌下将感受态细胞分装至1mL灭菌EP管（每管100μL），液氮速冻贮存于－80℃可保存半年。

③质粒转化（热激法）：从－80℃冰箱中取100μL感受态细胞悬液，冰上放置使其解冻，解冻后立即置于冰上；每管加入连接产物或质粒DNA溶液（含量不超过250 ng，体积不超过10 μL），轻轻混匀，冰上放置30 min；42℃水浴或金属浴中热休克90 s，然后迅速置于冰上冷却5min；向每管中加入1mL无抗性的LB液体培养基，混匀后37℃振荡培养45～60min，使细菌恢复至正常生长状态，表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr）；将上述菌液摇匀或全部离心富集后，无菌操作台中取100μL涂布于含Amp的筛选平板上，吹干平板20～30min，并做好标记，待菌液完全被培养基吸收后倒置于37℃培养箱中，培养16～24 h。

④将第①步的目的回收片段与pMD20-T载体相连：在微量离心管中配制pMDTM20-T Vector 1.0μL、DNA 0.1 pmol～0.3 pmol、dH2O up to 5μL DNA溶液，全量为5μL；加入5μL（等量）的Solution I（购自TaKaRa公司）；16℃反应30 min［室温（25℃）也能正常进行连接反应，但连接效率稍微降低；5min也能正常进行连接反应，但连接效率稍微降低；长片段PCR产物（2 kbp以上）进行连接时，连接反应时间请延长至数小时］；全量（10μL）加入至100μL的JM109感受态细胞中，冰中放置30min；42℃加热45s后，再在冰中放置1min；加入890μL的LB培养基，37℃振荡培养60min；在含有Amp的LB固体平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落；挑选白色菌落，使用菌落PCR法等确认载体中插入片段的长度大小，移至锥形瓶中37℃250 r／min培养12 h后进行下述操作。

1.2.5 质粒小量提取：将37℃培养12～16 h的平板取出，于无菌操作台中挑取单个克隆放入15mL氨苄青霉素抗性（100 μg／mL）的LB培养基中，于37℃250 r／min摇菌过夜。对目的片段经PCR鉴定正确的菌液进行质粒提取，质粒提取按试剂盒操作说明进行。

1.2.6 质粒测序鉴定：对酶切鉴定正确的重组T载体进行完全反应的测序鉴定，并与GenBank公布的序列进行Blast比对（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／nuccore／NM_001178081.1）。

1.2.7 STAT6过表达慢病毒表达载体pLVTHm-STAT6-ORF构建与鉴定

①慢病毒表达载体pLVTHm线性化：pLVTHm载体采用内切酶Cla I和Mlu I进行双酶切反应，获得粘性末端线性化目的片段，酶切反应体系及条件同上。双酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳5 h（电压为60 V）、使用胶回收试剂盒回收线性化片段，产物－20℃保存备用，用于后续连接反应。

②STAT6-ORF粘末端片段的获得：将测序正确的重组T载体质粒进行Cla I和Mlu I双酶切反应，酶切体系及反应条件同上。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳3 h（电压为60 V）、使用胶回收试剂盒回收粘性末端目的片段，产物－20℃保存备用，用于后续连接反应。

③pLVTHm-STAT6-ORF体外重组质粒的获得：将回收的STAT6-ORF片段与pLVTHm线性化片段按4∶1（摩尔比）的比例进行连接，连接反应条件为16℃连接过夜，构建重组慢病毒表达载体pLVTHm-STAT6-ORF。

④重组质粒的鉴定：将连接反应产物进行转化后，于37℃培养过夜；次日，挑取单个菌落接种到5mL含氨苄青霉素抗性的LB培养基中，37℃下进行培养，然后对菌液进行PCR鉴定，反应条件同上。经PCR鉴定正确的菌液通过质粒小量提取后，进行Cla I和Mlu I双酶切鉴定，酶切反应体系同上。将双酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果，根据片段的大小来确定重组载体质粒是否构建成功。

2 结果

2.1 RNA鉴定 成功提取总RNA RNA浓度为339.2μg／mL，纯度为2.02（A260／A280）。

电泳鉴定：琼脂糖凝胶电泳检测结果出现相应的条带（见图1），表明总RNA提取成功，可以进行反转录反应。

图1 总RNA电泳图Fig.1 Total RNA electrophoresis

2.2 cDNA鉴定 反转录反应cDNA浓度为2620.1μg／mL，纯度为1.96（A260／A280）。

2.3 成功扩增STAT6基因

2.3.1 对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，在相应的位置出现明显的条带（见图2），表明成功克隆STAT6基因。

图2 PCR扩增STAT6基因的鉴定Fig.2 Determination of STAT6 gene amplified by PCR

2.3.2 测序结果鉴定：应用高保真酶和自行设计的引物进行PCR扩增，PCR结果显示成功扩增了STAT6基因ORF的全长片段2544 bp，电泳鉴定后克隆到T载体上，测序验证结果（部分）经Blast比对，表明扩增的STAT6-ORF没有发生突变。

2.4 STAT6-ORF表达载体构建

2.4.1 双酶切鉴定：成功克隆STAT6-ORF后，连接到T载体上，经过测序鉴定后，用Cla I和Mlu I双酶切，回收STAT6-ORF片段，再通过T4 DNA连接酶连接到pLVTHm表达载体上，获得大小与STAT6-ORF相符的约2500 bp大小的片段。

2.4.2 测序鉴定：酶切鉴定后，pLVTHm-STAT6-ORF表达载体进行测序鉴定，测序结果（部分）显示插入序列无碱基突变，表明过表达载体pLVTHm-STAT6-ORF构建无误。

3 讨论

JAK-STAT信号通路是细胞内除Ras-MAPK之外另一条重要的致癌信号通路，其关键分子STAT家族，迄今为止发现有7个成员，包括STAT1、2、3、4、5a／b和6［1］。近年来，STAT6的研究普遍受到关注，而该蛋白本身具有生理和病理的双重功能［2］。生理方面，STAT6是IL-4介导辅助型T细胞向Th2型分化所必需的上游转录因子，IL-4信号激活STAT6表达，产生相应的生物学反应［3-4］，如IgE的产生，淋巴细胞的发育及Th2细胞的分化等等。此外在敲除STAT6基因的小鼠模型中，研究发现STAT6基因被敲除的淋巴细胞产生大量的Th1类细胞因子，如肿瘤坏死因子α，IL-12，干扰素γ等［5-6］，这说明STAT6在机体免疫系统中扮演了重要的角色。病理方面，在肿瘤细胞中，研究发现激活STAT6的表达，具有抗肿瘤的作用，过表达STAT6则表现为促进肿瘤细胞的分裂，抗凋亡，以及促进肿瘤细胞的转移，而对STAT6缺失、干扰或表达受抑制，表现为肿瘤细胞增殖减缓，周期受到抑制，促凋亡和肿瘤细胞的转移受阻［12-14］。由此可见STAT6信号转导途径与肿瘤的发生发展关系密切，但其在不同肿瘤中的作用机制却不一致，有关肿瘤细胞中STAT6基因功能学相关研究现在正成为热点［15］。本研究通过构建带有EGFP标记的STAT6过表达慢病毒表达载体，实验结果显示，pLVTHm-STAT6过表达可以进行慢病毒包装与鉴定。

［1］Aravalli RN，Steer CJ，Cressman EN.Molecular mechanisms of hepatocellular Carcinoma［J］.Hepatology，2008，48（8）：2047－2053.

［2］池俊萌，吴传新.原发性肝癌的治疗进展［J］.广东医学，2010，31（18）：2466－2468.

［3］褚大同.肿瘤分子靶向治疗的进展及问题［J］.临床肿瘤学杂志，2006，11（1）：1.

［4］汤钊猷.中西医结合治疗肝癌的思考［J］.临床肝胆病杂志，2011，27（5）：449－450.

［5］Nelms K，Keegan AD，Zamorano J，et al.The IL-4 receptor：signaling mechanisms and biologic functions［J］.Annu Rev Immunol，1999，17（9）：701-738.

［6］Callard RE，Matthews DJ，Hibbert L.IL-4 and IL-13 receptors：are they one and the same［J］.Immunol Today，1996，17（3）：108-110.

［7］Leonard WJ，O'Shea JJ.Jaks and STATs：biological implications［J］. Annu Rev Immunol，1998，16（8）：293-322.

［8］Rahaman SO，Vogelbaum MA，Haque SJ.Aberrant Stat3 signaling by interleukin-4 in malignant glioma cells：involvement of IL-13Ralpha［J］.Cer Res，2005，65（7）：2956-2963.

［9］Smerz-Bertling C，Duschl A.Both.interleukin 4 and interleukin 13 induce tyrosine phosphorylation of the 140-kDa subunit of the interleukin 4 receptor［J］.JBiol Chem，1995，270（2）：966-970.

［10］Takeda K，Tanaka T，Shi W，et al.Essential role of STAT6 in IL-4 signalling［J］.Nature，1996，380（6575）：627-630.

［11］Hebenstreit D，Wirnsberger G，Horejs-Hoeck J，et al.Signaling mechanisms，interaction partners，and target genes of STAT6［J］. Cytokine Growth Factor Rev，2006，17（3）：173-188.

［12］Ansel KM，Djuretic I，Tanasa B，et al.RegμLation of Th2 differentiation and IL-4 locus accessibility［J］.Annu Rev Immunol，2006，24（20）：607-656.

［13］Ostrand-Rosenberg S，Grusby MJ，Clements VK.Cutting edge：STAT6-deficientmice have enhanced tumor immunity to primary and metastatic mammary carcinoma［J］.J Immunol，2000，165（11）：6015-6019.

［14］Ostrand-Rosenberg S，Sinha P，Clements V，et al.Signal transducer and activator of transcription 6（STAT6）and CD1：inhibitors of immunosurveillance against primary tumors andmetastatic disease［J］. Cancer Immunol Immunother，2004，53（2）：86-91.

［15］Ni Z，Lou W，Lee SO，Dhir R，et al.Selective activation ofmembers of the signal transducers and activators of transcription family in prostate carcinoma［J］.JUrol，2002，167（4）：1859-1862.

（编校：王俨俨）

Effect of Nesfatin-1 on secretion mechanism of gastric acid and pepsin in rat gastric mucosa

LIU Jin-zhou1，YANG Yan2，XIE Er-fu3

（1.Department of Internal Medicine，Yichun People's Hospital of Jiangxi Province，Yichun，336000，China；2.Yichun Vocational Technical College，Yichun，336000，China；3.Department of Medical Sciences，Nanjing Medical University，Nanjing，210029，China）

ObjectiveTo observe the effect of Nesfatin-1 on secretion of gastric acid and pepsin in rats gastric mucosa，and explore its possible mechanism.Methods18 male SD rats after intracerebroventricular catheter were divided into，high dose group，low dose group and contral group，each ratwas injected with Nesfatin-1 0.05 g，0.5 g and 5μL equal volume sterile water by the lateral ventricle injection respectively.Gastric juice were collected by pylorus ligation，after 3h the ratswere executed tomeasure changes of their gastric acid and pepsin，and H＋-K＋-ATPase expression levels in gastric tissue was detected by RT-PCR，protein expression levels of histidine decarboxylase（Histidine decarboxylase，HDC）in gastric mucosa was detected by Western blot，histamine content in gastricmucosa was detected by ELISA.ResultsAfter3h of ratswith Nesfatin-1 injection，compared with control group with equal volume of sterile water for injection，the secretion of gastric acid and pepsin was significantly reduced，there was a significant difference（P＜0.01）.The difference of pepsin secretion level between the two groupswas statistical significance（P＜0.05）.Histamine secretion in rat gastric mucosa declined，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Compared with the control group，after treatment，two groups of rats gastric H＋-K＋-ATP enzymemRNA expression was significantly reduced，the differencewas statistically significant（P＜0.01）.Meanwhile HDC protein expression in ratgastricmucosa in high dose group，low dose group decreased significantly compared with the control group，the presence of differences，with statistical significance（P＜0.05）.Conclusion Intracerebroventricular injection Nesfatin-1，could inhibit the secretion of gastric acid and pepsin，and itsmechanism may inhibit gastric acid secretion by affecting the central nervous system，H＋-K＋-ATP enzymemRNA expression levels，expression of key enzymes.in histamine synthesis pathway.

lateral ventricle injection；rat；gastric acid；pepsin

R392.12

A

1005－1678（2014）08－0069－04

国家自然科学基金（81101322）

刘锦宙，男，本科，副主任医师，研究方向：消化内科，E-mail：qch1821460064＠163.com。