正交试验法优选咖啡渣中脂肪酸的提取工艺△

李永辉，谭银丰，张俊清*，廖小平*

(1.海南省热带药用植物研究开发重点实验室，海南 海口 571199；2.海南医学院药学院，海南 海口 571199)

中药工业

正交试验法优选咖啡渣中脂肪酸的提取工艺△

李永辉1，2，谭银丰1，2，张俊清1，2*，廖小平1，2*

(1.海南省热带药用植物研究开发重点实验室，海南 海口 571199；2.海南医学院药学院，海南 海口 571199)

目的：优选咖啡渣中脂肪酸的提取工艺。方法：以提取物中总脂肪酸的得率为指标，通过正交试验法优化脂肪酸的提取工艺参数。结果：最佳提取工艺为8倍量的丙酮提取3次，每次3 h，所得脂肪酸得率为17.06%。结论：优选的工艺提取效率高、结果稳定，为咖啡渣中脂肪酸类成分的工业化生产提供参考。

咖啡渣；脂肪酸；正交试验

咖啡树属于茜草科(Rubiaceae)植物，主要为阿拉比卡种Coffea Arabica和罗布斯塔种Coffea Robusta/Coffea Canephora，通常为乔木或灌木，生长于热带非洲和印度洋岛屿，在我国主产于海南和云南等热带亚热带地区，其果实咖啡豆是生产咖啡饮料的主要原料[1]。咖啡渣是咖啡饮品在加工过程中产生的副产物，其重量约占咖啡豆的2/3，咖啡生产过程中会产生大量的咖啡渣[2]，造成资源浪费和环境污染。研究表明咖啡渣中含有较丰富的油脂、糖类和蛋白质等成分，其中油脂类成分的含量高达14%以上，在咖啡加工过程中主要残存在咖啡渣中而被废弃。研究表明咖啡渣中油脂类成分主要包括棕榈酸、亚油酸、油酸和硬脂酸4种脂肪酸[3]，其中不饱和脂肪酸亚油酸和油酸的含量占咖啡渣油脂成分的2/3左右，不饱和脂肪酸具有抗氧化、降血脂、调节免疫、降低糖尿病并发症等多种药理功效[4-7]。因此，充分挖掘和利用咖啡渣废弃物中的脂肪酸类成分，实现废物的再利用，开发具有保健治疗作用的健康食品或药品，具有重要实用价值和现实意义。

目前咖啡油的提取工艺报道较少，主要是采用索氏抽提法，连续提取8 h才能达到最佳提取率[8]。由于提取工艺繁琐、提取时间长，难以实施产业化生产，制约了咖啡渣中油脂的资源化利用。笔者在前人研究基础上，针对咖啡渣中的脂肪酸类成分，对其提取工艺进行优化，以期为咖啡渣中脂肪酸类成分的工业化生产提供可行的方法；并运用气相色谱法对咖啡渣中脂肪酸类成分进行定量分析，为咖啡渣中脂肪酸类成分的资源化利用提供科学依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

咖啡渣由海口力神咖啡饮品有限公司提供，置阴凉处晾干即得。

棕榈酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：190029-201202)，十七烷酸(内标，Merck公司，99%)，15%三氟化硼(成都格雷西亚化学技术有限公司，批号：201302161)，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HH-W420三用恒温水浴锅(江苏省金坛市医疗仪器厂)；RE-R52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；GC-14C气相色谱仪(岛津公司)；XS105 Dual Range分析天平(梅特勒托利多公司)。

2 方法与结果

2.1 咖啡渣总脂肪酸的含量测定方法

2.1.1 咖啡渣脂肪酸样品的制备 精密称取咖啡渣样品约20.0 g，加入不同量的丙酮溶剂，按照表1中正交试验设计要求进行提取，提取液50 ℃减压浓缩至小体积，转移至蒸发皿中蒸发至干，即得咖啡渣脂肪酸样品。

2.1.2 对照品和脂肪酸样品的甲酯化 精密称取棕榈酸对照品或咖啡渣脂肪酸提取物适量，置50 mL圆底烧瓶中，加入十七烷酸内标约10 mg、2 mo1·L-1的氢氧化钾甲醇溶液4 mL，接上冷凝管，置85 ℃水浴上加热，并使溶液沸腾，5 min后从冷凝管顶部加入15%的三氟化硼-甲醇溶液5 mL，继续沸腾2 min，再从冷凝管顶部加入环己烷2 mL，继续沸腾1 min。取下冷凝管，加入饱和氯化钠溶液，至液面接近瓶口，取上层有机层，经无水硫酸钠干燥后，即得对照品甲酯化溶液或脂肪酸样品甲酯化溶液。

2.1.3 色谱条件 色谱柱HP-5石英毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；载气：高纯氮气；流速：1.0 mL·min-1；分流比：50∶1；进样口温度：300 ℃；程序升温：160 ℃保持3 min，以4 ℃·min-1升至280 ℃，保持5 min；进样量：1 μL；检测器：FID检测器，检测器温度：250 ℃。在该条件下，咖啡渣中脂肪酸可以基本实现基线分离，且内标对样品测定无干扰。色谱图见图1。

1.棕榈酸甲酯 2.十七烷酸甲酯(内标)A.对照品 B.供试品(不含内标) C.供试品(含内标)图1 脂肪酸提取物及对照品GC图

2.1.4 标准曲线绘制 取棕榈酸对照品约10，15，30，60，90，120 mg，精密称定，按2.1.2项下进行甲酯化后依法测定，以棕榈酸与十七烷酸的质量比Mi/Ms为横坐标(X)，棕榈酸甲酯与十七烷酸甲酯的峰面积比Ai/As为纵坐标(Y)进行线性回归。得棕榈酸的回归方程为Y=1.669 9X-1.003 2(r=0.999 1)，表明棕榈酸在质量比0.99～12.64呈现良好的线性关系。

2.1.5 精密度试验 精密吸取棕榈酸对照品溶液，连续重复进样6次，计算棕榈酸与十七烷酸的峰面积比，计算RSD=1.32%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 分别取放置了1，2，4，6，8，12 h的咖啡渣脂肪酸样品溶液，测定棕榈酸与十七烷酸的峰面积比，计算RSD=1.81%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.1.7 样品测定 在上述色谱条件下，吸取供试品溶液1 μL，进样，测定，计算棕榈酸、亚油酸、油酸和硬脂酸的峰面积和，以峰面积和与十七烷酸的比值，按照标准曲线方程计算各样品中总脂肪酸的含量。

2.2 正交试验

精密称取咖啡渣9份，每份20.0 g，以丙酮进行提取。采用L9(34)正交设计，选择溶剂用量、提取时间、提取次数为考察因素[9-10]，每个因素设3个水平，以提取物量和总脂肪酸量为指标，考察不同因素水平对咖啡渣中脂肪酸提取率的影响。正交试验因素水平表见表1，正交试验设计及结果见表2，方差分析见表3和表4。

表1 咖啡渣中脂肪酸提取工艺正交试验因素水平表

表2 咖啡渣中脂肪酸提取工艺正交试验

表3 咖啡渣中提取物量方差分析

注：(1)n=2，(2)F(2，2)=19.0；下同

表4 咖啡渣中总脂肪酸量方差分析

对表2数据进行直观分析可知，以提取物量为评价指标，其最佳提取工艺条件为A2B2C3，各因素的影响顺序为C>A>B。以总脂肪酸提取量为评价指标，其最佳提取工艺条件为A1B3C3，各因素的影响顺序为C>B>A。表3、4方差分析结果表明C因素对提取物量的影响有统计学意义，B和C因素对总脂肪酸量的影响有统计学意义。综合上述分析，结合实际情况，确定方案A1B3C3为最佳提取工艺条件，即用8倍量的丙酮，提取3次，每次3 h。

2.3 验证实验

为了考察优选的提取工艺稳定性，另取咖啡渣样品3份，每份20.0 g，加8倍量的丙酮，提取3次，每次3 h，分别测定总脂肪酸含量，计算脂肪酸得率。结果表明3份提取物中平均得到的脂肪酸量为3.412 g，得率为17.06%。验证实验结果与正交试验结果相差不大，表明采用优选的工艺参数进行提取，其总脂肪酸含量较高，且工艺稳定可行。

3 讨论

对咖啡渣中脂肪酸类成分的提取工艺优化实验中，分别选用了95%工业乙醇、丙酮提取法和超临界CO2萃取法进行筛选，结果显示工业乙醇和超临界萃取法对咖啡渣中脂肪酸的萃取率比较接近，且远远低于丙酮的萃取率，仅为丙酮萃取的60%左右。因此选择丙酮作为咖啡渣中脂肪酸类成分的较佳提取溶剂。在提取评价时，综合考虑提取物得到的提取物量和总脂肪酸量。

实验过程中对咖啡渣脂肪酸样品的甲酯化产物进行了GC-MS鉴定。结果显示4个脂肪酸化合物分别为棕榈酸甲酯(tR=16.0)、十七烷酸甲酯(tR=18.4)、亚油酸甲酯(tR=20.0)、油酸甲酯(tR=20.1)和硬脂酸甲酯(tR=20.7)。按照最佳提取条件，提取物中4种脂肪酸的含量占总提取物的64.3%(g/g)，显示提取物中脂肪酸含量较高。

脂肪酸的含量测定一般采用GC法[11-12]，实验中采用棕榈酸作为对照品对4种脂肪酸进行了整体定量，其结果会有一定的误差。然而考虑到其结果对工艺研究影响较小，未进行多指标定量。同时实验中亚油酸甲酯和油酸甲酯未获得基线分离，作者曾经尝试降低梯度升温速率，试图获得更好的分离效果。然而当梯度速率降低至0.5 ℃·min-1时，分离效果仍未有明显改善，考虑到分离效果对工艺研究影响较小，因此最终采用了4 ℃·min·的升温速率。

实验优选的工艺提取效率高、结果稳定，为咖啡渣中脂肪酸类成分的工业化生产提供参考。

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Optimization of Extraction Process of Total Fatty Acids from Coffee Residue by Orthogonal Test Design

LI Yonghui1，2，TAN Yinfeng1，2，ZHANG Junqing1，2*，LIAO Xiaoping1，2*

(1.HainanprovincialkeylaboratoryofR&Dontropicalherbs，Haikou571199，China； 2.SchoolofPharmacy，HainanMedicalUniversity，Haikou571199，China)

Objective：To optimize the best of fatty acids extraction methods from coffee residue.Methods：The best extraction method was investigated using the yields of total fatty acids and optimized through orthogonal test design.Results：The conditions with highest fatty acids yield were obtained as follows：the extraction solvent was acetone，the ratio of material-solvent was set 1∶8 (m/v)，extracting for 3 times with 3 hour each time.Under these conditions the yield of total fatty acids can reach 17.06% (g/g).Conclusion：The optimized extraction method was high efficiency and stable，can provide some reference for the industrialization of fatty acids in coffee residue.

Coffee residue；Fatty acids；Orthogonal test design

海南省社会发展科技专项(2011SF012)，海口市重点科技计划项目(2012-54)

*[通信作者] 张俊清，教授，博士，研究方向：新产品开发，E-mail：jqzhang2011@163.com；廖小平，教授，研究方向：神经药理学，E-mail：249765241@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.01.012

2013-05-20)