3株厌氧产电菌的分离与特性

邹然，朱葛夫，张净瑞，刘紫璇，刘超翔，黄栩

（1中国科学院城市环境研究所，福建 厦门 316021；2兰州理工大学土木工程学院，甘肃 兰州 730050）

对微生物燃料电池（MFC）的研究发现，外加一定电压可使体系在降解污染物的同时产生氢气，Logan等[1-2]于2005年首次把这种新的产氢技术称为微生物电解池（MEC）。目前对MEC的研究主要以MFC已有的研究成果为基础，重点集中在以下4个方面：反应器的设计[3-4]，底物的选择[5-6]，电极材料的优化[7-8]，微生物的研究[9-10]。产电菌作为MEC的重要微生物，在降解有机物和转移电子方面发挥重要作用。但目前，大部分产电菌是从 MFC中分离出来后应用于MEC中，直接从MEC中分离出来的产电菌较少[11-12]。而已经从MFC中分离出的产电菌种类主要有地杆菌 （Geobacteracae）[13]、 希瓦氏菌 （Shewanella）[14]、 假单孢菌（Pseudomonas）[15]、梭菌（Clostridium）[16]、脱硫单菌（Desulfuromonas）[17]和铁还原红育菌 （Rhodofoferax ferrireducens）[18]等。其中以地杆菌、希瓦氏菌和假单孢菌属的研究居多，而其他种类的产电菌少见报道。

厌氧“发酵障碍”是厌氧代谢中的一大难题。“发酵障碍”是指在厌氧代谢过程中，中间产物挥发酸的积累抑制发酵菌群对有机物进一步的降解，从而降低微生物对碳源的利用率，影响系统的稳定性[19-20]。而产电菌群能够以多种厌氧代谢中间产物作为底物生长，若将产电菌群引入厌氧代谢体系中，实现产酸发酵菌群和产电菌群对有机物梯级利用，则能够为厌氧代谢提供一种新途径。而实现产酸菌和产电菌生态位的耦合则是达到这一目的的关键，因此，筛选分离出能以多种挥发酸为底物、耐酸能力较强、具有较强电化学活性产电菌的研究工作显得尤为重要。

本研究中以 MEC电极生物膜作为产电菌分离的菌源，采用Hungate厌氧菌培养技术成功分离出3株产电菌，通过考察其生理生化特征探讨了其应用于解决厌氧“发酵障碍”的可行性。同时，测定了菌株产电活性，为探讨其在 MFC中的应用潜力和范围提供了依据。

1 材料与方法

1.1 菌种的分离和纯化

1.1.1 菌种来源

用于分离产电菌的微生物样品取自本实验室运行的一个单室MEC。该MEC是以乙酸钠为底物，以产氢气为主要目的。样品采集时，MEC已稳定运行 90天，其期间的氢气产率为(2.8±0.1) mLH2/(mgCOD)，能量效率值为138.6±3.1%。

1.1.2 培养基

液体培养基的组成：胰蛋白胨4.0 g/ L、牛肉浸膏4.0 g/ L、酵母1.0 g/ L、CaCl20.2 g/ L 、NaCl 5.0 g/ L、乙酸钠16.0 g/ L、FeSO4.7H2O 0.2 g/ L、MgCl20.2 g/ L、K2HPO41.2 g/ L、半胱氨酸1.0 g/ L、柠檬酸铁5.0 mmol/L、M液和V液各5.0 mL/L[21]、1 g/L的刃天青0.4 mL/L，调节pH值为7。

固体培养基的组成：在液体培养基的组成成分之外再加入15～20 g/L的琼脂粉。

1.1.3 分离操作方法

在厌氧无菌条件下，从 MEC电极膜上裁剪一小片（2.0 mm×2.0 mm），投入含已灭菌的液体培养基的厌氧瓶中，密封后置于37 ℃条件下富集培养5天。将富集后的液体培养基进行梯度稀释，选择10−4、10−5、10−6、10−74 个稀释度的菌悬液接入固体培养基中，冷水浴中滚管后，垂直放置于37℃恒温培养箱中厌氧培养 1～2 周。选择大小适中、相距较远的菌落，用接种针在无菌厌氧环境中将其接种于液体培养基中扩大培养5天。重复上述滚管分离和扩大培养操作4次，至滚管中固体培养基上形成的菌落形态相对一致。

1.2 16S rDNA基因扩增与测序及系统发育树的构建

对分离得到的单菌落进行扩大培养后，吸取部分菌液离心并收集的菌体。采用美国OMEGA公司的土壤DNA试剂盒提取DNA。PCR扩增引物为：27F （ 5′-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3′） 和1492R（5′-TACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR 反应条件为：94 ℃预变性3.00 min、94 ℃变性l.00 min、54 ℃退火0.75 s、72 ℃延伸1.50 min、30个循环，最后72 ℃延伸5.00 min。PCR产物分别通过琼脂糖电泳和Nanodrop （Thermo Fisher Scientific）定性和定量。经切胶纯化的PCR产物交由上海美吉生物技术有限公司完成测序。将菌株的16S rDNA测序结果提交GenBank核酸序列数据库进行BLAST比对，使用DNAMAN将其与同源性较高的产电菌的16S rDNA序列进行比对，采用最大似然法绘出系统发育树并进行稳定性检验（1000次）。根据测序结果确定3种细菌作为进一步研究对象，分别标记为Z1、Z2和Z3。

1.3 形态特征观察和生理生化实验

首先对3种细菌进行了革兰氏染色，并采用穿刺法测定了其厌氧特性。菌株的形态特征采用日本日立扫描电镜（S-4800）进行观察，样品首先用2.5%戊二醛固定4 h，然后用0.1 mol/L 磷酸缓冲液清洗3次，每次15～30 min，最后用50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇和100%乙醇各洗脱30 min。观察前通过日本日立临界点干燥仪（HCP-2）进行干燥，用电子溅射镀膜仪（Gatan Model 682）在表面镀一层15.0 nm厚度的金属膜，再进行观察拍照。

接着，选择初始pH值、温度、NaCl浓度、碳源 4个参数的不同水平研究了菌株的生理生化特点。初始pH值的水平设为4、5、6、6.5、7、7.5，温度水平设为15 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃，NaCl质量分数为0、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%，碳源选择蔗糖、淀粉、葡萄糖、丁酸钠、丙酸钠、乙酸钠。实验中，以2.0%（体积分数）接种量将菌悬液接种到装有10.0 mL培养液厌氧管中，分别在各参数的不同水平下培养24 h，以未接种的培养液作为空白对照，采用紫外分光光度计在波长660.0 nm处测定各组试验的OD值。

1.4 产电性能测定

通过循环伏安法测定3株纯菌的产电性能，实验设置空白组和实验组，空白使用无菌水溶液，实验组为添加菌液的溶液。采用Ag/AgCl为参比电极，玻碳电极为工作电极，扫描速率50.00 mV/s，扫描范围−600.00～600.00 mV。

采用单室MFC反应器启动，阳极和阴极分别采用碳布（2.0 cm×4.0 cm）和不锈钢网（2.0 cm×4.0 cm），外阻为10 Ω，以钛丝构成闭合回路，系统采用间歇式方式运行。启动的接种污泥取自厦门市集美区污水处理厂二沉池，污泥的MLSS和MLVSS分别为16.78 g/L和9.2 g/L，阴极液和阳极液都为葡萄糖为碳源的营养缓冲液，并加入微生物生长所需的微量元素。将菌株Z1、Z2和Z3扩大培养获得的菌悬液以1∶1∶1的体积比混合形成接种物，并以该接种物与 MFC接种污泥混合，考察了其对MFC启动和产电性能的强化作用。试验中设置实验组R1和对照组R2，R1为加入5.0%（体积分数，下同）的产电菌混合物（OD660nm值为1.10）和15.0%接种污泥的MFC，R2为只有15.0% （接种污泥的MFC，两组共运行3个周期，每个周期中当输出电压值小于20.00 mV的时候更换营养液，进入下一个周期的实验。

2 结果与讨论

2.1 分子生物学鉴定及系统发育学分析

通过厌氧培养和分离操作分离得到 3株纯菌Z1、Z2和 Z3，将菌株的 16S rDNA序列提交GenBank，将其16S rDNA序列在GenBank中进行BLAST比对。结果表明，Z1与Citrobactersp.Z7和Citrobactersp.LY2两种菌的相似性达到99.0%，Z2与Clostridiumsp.NHT33和Clostridiumsp.NHT54两种菌的相似性达到 99.0%；Z3与Clostridiumsp.PPf35E10和Clostridiumsp.YN5两种菌的相似性达到99.0%。以分离的3个菌株与其遗传相似性较高的6个菌株构建系统发育树，结果如图1所示。从图1中可以看出，菌株Z1属于柠檬酸杆菌属（Citrobacter），菌株Z2和Z3属于梭菌属（Clostridium）。虽然本研究中分离出来的Z1、Z2、Z3菌株分别与Citrobactersp.Z7、Clostridiumsp.NHT33、Clostridiumsp.PPf35E10等6株菌相似性较大，但关于此类菌株的生理生化特征及应用领域的研究少见报道。因此，有必要对所分离菌株进行生理生化特征及其在解决厌氧“发酵障碍”和MFC应用潜力方面的探究。

2.2 菌株革兰氏染色与SEM形态特征观察

Hungate滚管固体培养基中3株菌落都接近圆形，直径约0.5 cm，表面光滑，菌落边缘整齐，中间颜色较深，边缘颜色较浅。Z1有带丝状，为微黄色，Z2和Z3菌落为乳白色。革兰氏染色结果表明，菌株Z1为革兰氏染色阴性（G−），Z2和Z3为革兰氏染色阳性（G+）。厌氧性测定结果为Z1为兼性厌氧菌，Z2和Z3为严格厌氧菌。图2为3个菌株的SEM 照片，从中可以看出，菌株 Z1 、Z2 和 Z3的菌体均为杆状，长约2.0～3.0 μm，宽约0.4～0.6 μm，单生，无鞭毛，Z1无芽孢，Z2和Z3有芽孢。菌株 Z1的上述特征与伯杰氏系统细菌学手册中关于柠檬酸杆菌属特征描述相符，而菌株Z2和Z3的上述特征则与梭菌属的特征描述相符合[22-23]。

图1 基于16S rDNA基因序列绘制的菌株Z1、Z2和Z3系统发育树

图2 菌株Z1、Z2和Z3的扫描电镜图像

2.3 菌株的生理生化特征

2.3.1 菌株生长的pH值范围

pH值主要是从底物利用和对物质代谢途径两方面影响微生物的生理活动[21]。如图3(a)所示，在初始pH值7.0的条件下，Z3的长势最佳，而菌株Z1和Z2的最佳长势则出现在pH值为6.5时。随着pH值的降低，3株菌的长势逐渐下降，但pH值在5.0以上时，其生长代谢活性仍然较强，表现出较强的耐酸能力。与已报道的Clostridium属菌株[16]相比，菌株Z2和Z3具有更宽的pH值生长范围。在厌氧发酵系统中产酸相的最佳 pH值范围为 5.0～6.5，产甲烷相的最佳pH值范围为6.5～7.5[24]。分析认为，分离得到的 3株细菌，其适宜的增殖 pH值范围（5～7.5）与厌氧发酵系统的产酸相和产甲烷相的适宜pH值具有很好的匹配性，具有互营共生的潜力。

2.3.2 菌株的生长温度范围

从图3(b)中可以看出，在 15～40 ℃范围内，菌株Z1、Z2、Z3都能生长，但温度的变化对菌株的生长影响显著。从15 ℃开始，随着温度的升高，3个菌株的增殖加速，Z1的最适生长温度为35 ℃，而Z2、Z3最适生长温度为30 ℃，当温度高于最适温度时，菌株的增殖受到抑制，长势迅速下降。一般厌氧代谢体系的最佳温度范围为 25～35 ℃[25]，因此，菌株Z1、Z2和Z3在温度方面也与厌氧发酵系统具有良好的匹配性。

2.3.3 菌株的NaCl浓度耐受范围

图3 菌株的生理生化特征

离子强度能对 MFC的产电性能产生重要影响，因为较高离子强度将有利于电子传递，但同时可能会影响电极膜上产电菌的活性[26]。由图3(c)可知，菌株Z1、Z2和Z3在NaCl质量分数为0.5%时生长良好，随着NaCl浓度增加生长速率下降，NaCl质量分数达到5.0%时基本不生长，耐盐性不强，其最适NaCl质量分数为0.1%～2.0%。

2.3.4 不同碳源底物利用情况

从表1可以看出，3株菌株能都能利用蔗糖、淀粉、丙酸钠、乙酸钠作为碳源生长，Z2和Z3菌株还能够利用葡萄糖作为碳源生长，Z1能够利用丁酸钠作为碳源生长。这与已有的研究相似，Park等[16]从以淀粉作为电子供体的 MFC中分离出来的丁酸梭菌（Clostridium butyricumEG3）能以淀粉、纤维二糖、蔗糖等为碳源；Niessen等[9]也发现同属的拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）能利用淀粉、葡萄糖和乳酸为碳源等产电。而本研究中分离出的3株产电菌不仅能以多糖（淀粉）为碳源，还能以厌氧代谢中间产物（挥发性有机酸）为碳源生长，这为其与厌氧发酵产酸菌形成传质链的可行性提供了理论基础。此外，菌株底物的广谱性，对扩大MFC的应用范围具有较大的指导意义。

表1 菌株碳源利用情况

2.4 产电活性试验

2.4.1 循环伏安曲线测定

在循环伏安曲线中，峰高越高，氧化还原电势越高，细菌的产电能力越强，产电性能越好[27]。如图4所示，菌株Z1、Z2和Z3在−0.29 V左右都出现了明显的还原峰，氧化峰不明显，表明3株菌株具有相似的产电特征，且还原能力较强。在目前研究获得的产电菌，大多具有较强的氧化能，而还原能力较强的产电菌报道较少[28～30]，这可能与大部分研究关注于产电菌在 MFC阳极发挥作用有关[31]。然而，对于 MFC中应用较为普遍的催化阴极（铂和镍等）而言，因其在反应中容易失活，而造成反应体系不稳定[32]。因此，对生物阴极的研究需要加强，而且生物阴极的还原特性使其在高氯酸盐降解、重金属修复以及生物质能源产生方面具有较大应用前景[33-35]。

图4 菌株循环伏安曲线

2.4.2 产电菌对MFC启动和产电性能的影响

MFC启动运行结果见图5。由图5可见，在MFC启动运行的第一个周期中，R1运行12 天后，系统的输出电压即达到了20.00 mV，最高输出电压达到350.00 mV。而R2运行15 天后期系统输出电压方达到20.00 mV，其最高输出电压为317.80 mV。可见，产电菌的加入，不仅可以提高 MFC的反应周期，而且可以有效提高 MFC的产电效能。在随后的两个运行周期中，R1和R2的最大输出电压具有显著提高，但基本稳定，分别维持在482.50 mV和408.60 mV左右，也即R1的最大输出电压较R2增加了18.1%。

图5 MFC启动运行

分析认为，MFC在每个运行周期所表现出的电压迅速升高现象，是源于底物的充足。而随着有机物的不断降解，微生物因营养逐渐匮乏而活性下降，导致了MFC输出电压的降低。MFC的启动实际上是产电菌和其他种群微生物竞争后，在电极表面附着从而形成生物膜，同时转移电子和输出电压的过程。所以，产电菌的种类及能否形成优势种群是MFC成功启动的关键影响要素。R1中接种入分离的产电菌株后，丰富了产电菌的种类，增加了产电菌数量，从而有效缩短了运行周期，提高了输出电压。而这一结果同时证明了菌株Z1、Z2和Z3能够在以葡萄糖为底物、活性污泥为种源的 MFC系统中具有较强的生存能力，表现出了良好的种群竞争优势，可为强化MFC效能提供微生物种质资源。

3 结 论

（1）从MEC阴极的生物膜上分离得到3株产电菌 Z1、Z2和 Z3，Z1属于柠檬酸杆菌属（Citrobacter），Z2和 Z3属于梭菌属（Clostridium），3株菌株均具有较强还原能力。

（2）菌株Z1、Z2和Z3均为杆状菌。其中，Z1为G－，Z2和Z3为G+。Z1为兼性厌氧菌，Z2和Z3为严格厌氧菌。3株产电菌能够利用淀粉、单糖和挥发性脂肪酸为碳源生长。在pH值5～7.5的环境中增殖良好。Z1的最适生长温度为35 ℃，Z2、Z3最适生长温度为30 ℃。3株菌株在生理生态特征方面与厌氧发酵系统具有良好的匹配性能。

（3）在MFC启动时，加入菌株Z1、Z2和Z3的混合物，可显著缩短 MFC的启动周期，同时有效提高MFC的产电效能。

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