乙醇浓醪发酵技术研究进展

张强，韩德明，李明堂

（长春理工大学生命科学技术学院，吉林 长春 130022）

20世纪70年代全球性能源危机使生物质能源的开发和利用重新引起了人们的重视。目前，许多国家已经开始了生物质能源的开发，其中燃料乙醇的生产尤为引人注目。但燃料乙醇目前生产成本较高，缺乏市场竞争力，因此，最大限度降低生产成本对于燃料乙醇工业健康发展意义重大[1]。

乙醇生产过程中，发酵强度是考核发酵产业的一个重要指标。乙醇浓醪发酵技术是提高发酵强度的重要措施，即在发酵罐体积不变的情况下，通过提高乙醇浓度来提高乙醇的产量。浓醪发酵具有高细胞密度、高产物浓度和高生产速率等特点，是发酵工业的发展目标和方向。采用浓醪发酵可使发酵液中乙醇含量达到18%（体积比，下同）以上，而普通发酵只能产生9%～11%乙醇。因此浓醪发酵具有提高终点乙醇浓度、降低能耗、节约工艺用水、提高设备利用率等优势，从而有效降低了乙醇生产成本，具有广泛的应用价值[2]。

本文主要介绍了乙醇浓醪发酵定义、优势以及影响乙醇浓醪发酵的因素，重点对实现乙醇浓醪发酵技术的途径进行了综述。

1 乙醇浓醪发酵的定义

由于微生物菌种、发酵原料以及发酵产品的差异，因此对浓醪发酵底物浓度界限存在着明显的差别，目前对乙醇浓醪发酵还没有统一的定义，各方观点并不一致。浓醪发酵最初是由Casey等提出，他认为100 g发酵液中可溶性固形物大于或等于18 g即为浓醪发酵。传统发酵中，一般100 g发酵液中可溶性固形物含量为11～12 g，而达到13～16 g就被定义为浓醪发酵[3]。现在乙醇生产企业发酵醪液中含20%～24%的可溶固形物，被认为是正常浓度发酵，当糖化醪中含有30%或更高的可溶性固形物，则为浓醪发酵。当然，随着发酵技术不断进步，浓醪发酵标准有逐渐提高的趋势。

2 乙醇浓醪发酵的优势

乙醇浓醪发酵，单位时间内可获得更多的乙醇产物，因而与普通乙醇发酵工艺相比，浓醪发酵具有更加明显的优势。

2.1 节约用水

水是重要的反应物，没有足够水参与反应，会使醪液糊化液化不彻底，导致原料利用率下降。一般乙醇生产企业发酵所采用的料水比通常为1∶2.5左右，而采用浓醪发酵料水比可减为 1∶（1.8～2.0），因此每生产1 t乙醇可节约工艺用水2 t 以上，同时也减少了废水的排放。

2.2 降低酒糟（DDGS）的生产成本

酒糟是乙醇生产的副产物，是构成企业经济效益的重要产品，企业每生产1 t乙醇可得到900 kg左右的酒糟饲料。发酵醪浓度高，固形物含量也高，酒糟分离、干燥费用也低，DDGS生产成本也会相应降低。表1为不同乙醇浓度下废液量及酒糟干物质浓度对比，国内乙醇生产企业发酵成熟醪液的乙醇体积分数为9%～11%，因此每生产1 t 95%的乙醇，将产生约10.5 t糟液，酒糟中干物质质量分数为8%左右。从表1中可以看出，发酵液中乙醇浓度提高后，乙醇糟液量明显减少，酒糟中干物质质量分数显著提高，从而降低了DDGS生产成本[4]。

表1 不同乙醇浓度下废液量及酒糟干物质质量分数对比

2.3 降低能耗

乙醇生产中，除原料消耗以外，能耗是乙醇厂主要的支出之一，具体表现在煤和电的消耗上。乙醇生产过程中蒸煮、发酵、蒸馏和酒糟浓缩干燥等工段常常消耗大量的能耗。采用浓醪发酵技术可明显减少蒸汽用量.假如发酵液中乙醇浓度仅增加1%，仅蒸馏工段就可以节约蒸汽约150 kg。

2.4 提高设备利用率

由于浓醪发酵速度快，在基本相同或接近的发酵时间情况下，设备利用率可提高20%左右。

3 影响乙醇浓醪发酵的因素

乙醇发酵是一个复杂的生化反应过程，既包括动量、热量以及质量的传递，又包括微生物代谢过程，尤其对于乙醇浓醪发酵，影响因素更为复杂。

3.1 葡萄糖代谢的影响

葡萄糖是酵母菌进行乙醇发酵的主要营养物质。高浓度葡萄糖对酶的生物合成以及糖酵解过程酶活力都有不利影响，即葡萄糖阻遏作用。发酵初期，通常细胞所受糖的抑制作用大于乙醇的作用，因此解决高浓度葡萄糖的抑制作用是实现乙醇浓醪发酵的关键[5]。

3.2 乙醇的抑制作用

乙醇会对酵母菌产生毒害作用。 随着发酵液里乙醇浓度增加，乙醇对酿酒酵母的毒性随之增大。高浓度乙醇对细胞的毒害作用主要表现在对细胞形态和细胞生理活动影响两个方面。细胞形态变化主要表现为细胞骨架变得疏散。细胞生理活动变化主要体现在生物大分子物质的合成与代谢受阻以及糖酵解相关酶酶活性变化等。

对于一般酵母菌株来讲，当醪液乙醇含量超过23%时，酵母菌细胞就会死亡；当乙醇含量低于3.8%时，其对酵母菌细胞生长代谢几乎没有影响。

3.3 发酵工艺条件的影响

溶氧和温度是影响乙醇浓醪发酵的重要因素。

氧气除可以促进细胞生长外，还可以促进不饱和脂肪酸和类脂质等存活因子的合成。存活因子对于菌体抵抗乙醇毒性具有重要作用，但存活因子仅在氧气存在下才能合成。因此，溶氧的调控值得关注。

高温有利于乙醇发酵，但高温对浓醪发酵的影响远大于一般的乙醇发酵。由于浓醪发酵溶液的高渗作用，容易导致细胞膜破裂，而温度升高则会影响膜内脂的流动性，加速细胞膜的破裂。因此，温度的调控也值得关注。除了上述溶氧和温度两因素外，还有其他一些因素如pH值等对酵母菌的生长和发酵也有影响。

3.4 营养物质的影响

乙醇浓醪发酵过程中，添加适宜的营养物质，例如氮源和营养盐等，才能保证酵母菌生长健壮以及抵抗较高渗透压的影响，增加乙醇产出。因此营养物是一个非常关键的因素，及时添加这类营养物质对乙醇浓醪发酵极为重要。

4 实现乙醇浓醪发酵的途径

4.1 降低发酵醪液的黏度

乙醇浓醪发酵过程中，由于投料比例加大，势必会造成发酵醪液黏度增加。目前我国乙醇生产企业发酵成熟醪乙醇体积分数约为11%，而美国有的乙醇企业发酵醪乙醇体积分数已达 18%，并正向23%努力。根据发酵醪乙醇浓度，可以利用淀粉水解以及葡萄糖乙醇发酵反应式来计算水与玉米粉的调浆比例。反应式见式（1）、式（2）。

按照上述反应方程式，即可计算出不同乙醇浓度情况下淀粉用量以及玉米粉用量，从而可以确定水与玉米粉调浆比例，具体结果见表2。

从表2可知，随着乙醇浓度增加，水与玉米粉的调浆比例发生很大变化。当乙醇体积分数达到23%时，水与玉米粉的比例接近1∶1水平。因此要想达到预期的乙醇浓度，必须达到最基本的水与玉米粉混合理论比例。但这样的比例如果用细玉米粉调浆，很容易出现醪液黏度大造成物料输送不畅[4]。目前大多数乙醇生产企业采用的玉米粉碎粒度在1.6～1.8 mm之间，粒度过大会导致液化糖化不彻底，造成原料浪费；而粒度过小、粉碎过细会增加预处理的能耗。所以一些乙醇浓醪发酵企业，采用粗玉米粉，粉碎粒度直径约 3 mm，以降低玉米料液黏度，由于采用大颗粒粉碎，这样醪液中有“浓”有“稀”，效果比细粉好。

表2 不同乙醇体积分数下水与玉米粉的调浆比例

另外，随着α-淀粉酶和喷射液化技术在乙醇生产中应用越来越广泛，大大降低了成熟醪中残余淀粉的含量。浓醪发酵采用液化酶二次添加方式，能达到很好降低醪液黏度的效果[4]。黄宇彤[6]认为，玉米粉加热过程中黏度升高主要由于淀粉糊化和蛋白质变性引起的，因此在玉米粉糊化前，加入10 U/g的液化酶预处理20 min，可降低醪液黏度和峰值黏度持续时间，因此原料处理过程中糊化、液化的研究对于降低醪液黏度必将起到积极的作用。

4.2 筛选高耐性酿酒酵母

酵母是乙醇发酵的动力，发酵过程一般要求菌体：①繁殖速度快，发酵能力强；②具有较强耐乙醇能力，能进行浓醪发酵；③抗杂菌能力强；④对培养基适应性强。发酵过程中，随着发酵液里的乙醇浓度增加，乙醇对酵母毒性增大。研究表明，通过筛选、诱变、原生质体融合、基因重组等技术可提高乙醇酵母的耐受性，实现浓醪发酵。

吴华昌等[7]从白酒窖池的酒糟中分离筛选出一株耐18%乙醇的菌株A2。20%葡萄糖发酵72 h后，发酵液乙醇体积分数达到9.5%。伍彦华等[8]通过筛选获得一株自絮凝酵母FJY，以木薯为原料进行乙醇浓醪发酵，发酵86 h后，最终乙醇体积分数达到15.7%。

紫外诱变以及原生质体融合等技术是获得高耐性菌株常规而有效的手段。徐琳[9]对实验室自备的酵母菌进行紫外线诱变和杂交处理，选育出适合于浓醪发酵的高产酵母菌J-l-l-3，该菌株在料水比1∶2的发酵液中，发酵85～96 h乙醇含量达到14.1%。彭源德等[10]通过筛选以及紫外诱变育种，获得1株编号为 S132的耐受性优良乙醇酵母，能够耐受40 ℃高温和 16%乙醇。 王滨等[11]利用筛选出的酵母菌，经紫外线诱变原生质体，选育出乙醇高产菌株Y316-23。当料水比为1∶1.8时，发酵60 h，发酵醪的乙醇体积分数达到13.5%以上。刘建军等[12]利用热冲击、紫外线和γ-射线联合作用获得一株高产乙醇酵母NHY4-36 ，该酵母菌发酵可获得17.5%的乙醇，能够耐受20%以上的乙醇。

另外，湖北安琪集团采用活性干酵母在实验室进行淀粉质原料乙醇发酵，在料水比1∶（1.8～2），发酵醪液中淀粉质量分数23%～25%情况下，最终的乙醇体积分数达到了16%左右[13]。

4.3 添加酶制剂

各种酶制剂在淀粉质原料乙醇发酵过程中发挥着重要作用，但由于原料中淀粉及蛋白质含量的差异，其添加量、添加时间和添加方式也存在明显不同。

蛋白酶能够水解蛋白质，破坏淀粉颗粒间结构，有利于糖化酶的作用。另外蛋白酶水解蛋白质生成大量自由氨基氮物质，能够促进酵母生长与繁殖，也可促进未完全水解的淀粉和蛋白质的分离，从而降低发酵醪液的黏度。宋书玉等[14]在乙醇浓醪发酵过程中，添加适量的酸性蛋白酶，可缩短发酵周期至48 h，原料出酒率比对照提高约1.04%，吨乙醇可节省玉米用量102 kg。黄河[15]在玉米乙醇浓醪发酵过程中，酸性蛋白酶的添加量在20 U/g玉米时，乙醇浓度达到 14.8%，淀粉出酒率提高幅度最大。赵华等[16]在糖化结束后按4 U/g原料添加酸性蛋白酶，发酵70 h，醪液中乙醇体积分数可达13.2%。王晨霞等[17]在乙醇浓醪发酵工艺研究中发现，浓醪发酵中添加酸性蛋白酶，在起始总糖为28.25%的情况下，酒度达到15.94%，与对照相比，酒度提高了4.87%。

玉米原料除含有大量淀粉外 ，还含有一定 量与淀粉颗粒紧密结合的粗纤维和油脂等， 因此，添加适当酶制剂，可以破坏原料结构，充分发挥糖化酶作用，提高乙醇浓度。所丽娜等[18]探讨了添加乙醇复合酶（木聚糖酶和脂肪酶）对玉米乙醇浓醪发酵的影响。添加0.75 g/100 g原料的乙醇复合酶，发酵乙醇体积分数达到16.35%，料水比可达1∶2.2，表明添加乙醇复合酶对乙醇浓醪发酵有明显的促进作用。韩宏明[19]研究了木薯乙醇专用复合酶对木薯乙醇浓醪发酵的影响。表明添加木薯乙醇专用复合酶对木薯乙醇发酵有明显促进作用，与对照组相比，在料水比为1∶2.2的条件下，添加0.30 g/100 g原料的木薯乙醇专用复合酶，酒度达到13.13%。

另外，在谷物原料乙醇发酵中，添加适量的植酸酶不仅可以促进淀粉和蛋白质的降解，还可以将植酸盐转化为肌醇和磷酸盐，从而增加了酵母菌的营养，提高了菌体发酵强度。邱立友等[20]在玉米原料乙醇发酵醪中添加15 u/g 原料的植酸酶，原料出酒率可达39.81%，比对照组提高了6.96%。

4.4 改变发酵工艺模式

乙醇浓醪发酵，由于物料浓度高，物料的糊化、液化会变得非常困难。采用生料发酵，即原料不需蒸煮和预先糖化，直接进行发酵，可使发酵醪黏度降低，单糖的含量始终保持在较低的水平。

池振明等[21]利用高浓度乙醇酵母菌 HO，采用玉米面生料发酵，糖化酶加量为300 U/g 原料，当原料浓度为330 g/L时，酵母菌在70 h内可产生17.5%的乙醇；当原料浓度为360 g/L时，该菌株在96 h内可以产生 18%的乙醇。 许宏贤[22]以全磨玉米为原料，采用生料工艺发酵，底物浓度为350 g/L，使用市售乙醇干酵母，在98 h内发酵醪液乙醇浓度可达20%以上。马文超等[23]利用筛选的糖化酶作为糖化剂，进行玉米无蒸煮乙醇发酵，糖化酶添加量为100 U/g原料，料水比1∶2，30 ℃恒温发酵60～70 h，发酵醪乙醇体积分数达15%。

由于高浓度葡萄糖对酵母菌形成的高渗作用，抑制了酵母菌细胞的生长繁殖，所以葡萄糖应采用“定量供应”的办法。同步糖化发酵（SSF）将糖化与发酵过程相结合，葡萄糖一经水解即被酵母吸收转化为乙醇，可显著降低葡萄糖浓度，缓解高浓度葡萄糖对酵母的影响。

Sathaporn 等[24]采用固形物含量为 304 g/L 土豆原料，首先加入果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶降低原料的黏度，然后经过液化和糖化作用，30 ℃下进行SSF，乙醇产量为16.61%。晏辉等[25]以餐厨垃圾为原料，应用同步糖化发酵制取乙醇，在适宜的乙醇发酵条件范围内，乙醇体积分数达到10%。李志军等[26]使用安琪耐高温酿酒活性干酵母，以玉米为原料生产乙醇，采用SSF工艺，从三角瓶小试到5 t罐中试，最终乙醇体积分数达到13.6%。

另外，在乙醇发酵过程中，解除产物抑制也是提高乙醇发酵的关键。膜分离、抽提及闪蒸等工艺可有效地分离移除乙醇，降低或消除对酵母生长影响。Costa 等[27]在发酵过程中通过在发酵容器上方连接真空泵形成低压状态，可将挥发性高的乙醇从发酵液中抽提出来，从而获得了23.0～26.7 g/(L·h)的乙醇产率。常春等[28]采用蒸汽爆破的玉米秸秆为原料，采用预酶解补料和耦合真空分离技术进行活性干酵母乙醇发酵，当原料质量分数为30%时，乙醇得率为44.98%，有效提高了乙醇产量。以上乙醇分离工艺虽然理论上具有一定的可行性，但要真正实施却存在很多问题，例如需要增加附加设备以及相关材料投资，增加了乙醇的生产成本。

4.5 添加适宜的培养基成分

Casey等[29]认为，营养物质是酵母菌生长及代谢的重要物质，如果能够满足菌体的营养需要，可促进乙醇发酵速度和增加乙醇浓度。培养基是酵母菌营养和能量的来源，在发酵过程中起着非常重要的作用。高浓度的糖类导致渗透压的增加，会对酵母造成危害。大量研究发现，在培养基中加入适量的营养物质，如海藻糖、脂肪酸以及肌醇等，都可以有效提高酵母菌耐乙醇能力，增加在高浓度乙醇条件下酵母的存活率。

刘代武等[30]采用安琪耐高温乙醇活性干酵母，以玉米为原料进行浓醪发酵工艺条件的研究，发现适当添加无机盐和营养盐，发酵70 h，最终发酵酒度可达14.7%。

邢建宇等[31]研究发现饱和脂肪酸（例如棕榈酸、硬脂酸）和不饱和脂肪酸（例如油酸）都可以通过增强细胞膜渗透屏障来提高菌体的耐乙醇能力，表明它们在酿酒酵母乙醇耐受性方面具有一定的作用。胡纯铿等[32]在培养基中分别添加棕榈酸、亚油酸和亚麻酸，发现富含棕榈酸的酵母细胞存活率最高，菌体具有较强耐乙醇能力。

其他物质，如酵母膏、蛋白胨等也能够有效提高酵母菌的乙醇耐受性。邢建宇等[33]研究了培养基组分对酿酒酵母生长以及乙醇耐受能力的影响。发现酵母膏对酿酒酵母影响最大，分别提高酵母膏和蛋白胨含量，都可以在发酵各个阶段提高酵母细胞乙醇耐受性及发酵能力。

肌醇是磷脂的重要组分之一，而磷脂是细胞膜的最重要成分。季冉等[34]研究发现，高浓度肌醇能够对质膜ATP酶和质膜完整性起保护作用，以免受高浓度乙醇毒害，因此随肌醇浓度增加，酵母乙醇耐受能力随之增加。

另据报道，在酵母菌的培养基中添加粗卵磷脂、清蛋白、Tween80 或麦角固醇，也可以提高酵母菌的生长速度，缩短发酵时间[35]。

高底物浓度还会导致低水活性，从而造成对酵母细胞的毒害作用。为了维持细胞存活性，必须减小培养基的渗透压。薛颖敏等[36]利用渗透压保护剂和营养物质对酿酒酵母X330 耐乙醇性能进行了研究，发现甘氨酸和脯氨酸作为渗透压保护剂能有效提高菌体乙醇耐受性能，甘氨酸的促进作用强于脯氨酸。

5 结 论

乙醇浓醪发酵是一项极具前景的技术，不必对工厂现有设备进行大规模改造，却能降低生产成本，显著提高乙醇厂综合效益。它具有高细胞密度、高产物浓度和高生产速率等特点以及显而易见的优势，将大大改善目前我国乙醇工业的技术水平，是乙醇发酵工业的发展目标和方向。

但由于乙醇浓醪发酵中仍然存在一些问题，如高浓度糖化液的制备、浓醪物料的输送、高浓度葡萄糖以及高浓度乙醇对酵母的抑制作用等问题，需要不断进行研究。但浓醪发酵最重要、最根本的仍是酵母问题，如何选育具备更高的耐渗透压能力、更高的耐乙醇能力以及更强的发酵能力的酿酒酵母，是实现乙醇浓醪发酵的关键。可以通过两条途径获得高耐受性酵母菌株。一是通过直接筛选、诱变育种、细胞杂交等传统菌种选育方法，通过这些方法选育出来的菌种实用性强、生产稳定性好。二是通过基因工程以及原生质体融合等现代育种手段对酵母进行基因改造，从而获得高耐受性酵母菌株。同时也应该对酵母的乙醇耐受机理以及抗胁迫机制进行深入研究，从而有力推动乙醇浓醪技术的发展。

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