水蛭提取物对HL60细胞增殖与细胞周期的影响

★ 肖移生 侯吉华 李青 汪建民＊ (江西中医药大学基础医学院 江西 南昌330004)

中药水蛭性咸、苦、平，归肝、膀胱经，有破血瘀、散结聚、通经脉、利水道等功效，用于治癥瘕、痞块、血瘀闭经、跌打损伤等，其药理作用为抗凝、溶栓、抗血小板及降血脂等［1］;临床上水蛭也可单方或组方运用于肿瘤治疗中［2］。本课题组前期研究发现水蛭提取物对HL60细胞生长有抑制作用［3］，为进一步探讨，本课题组进行了水蛭提取物对HL60细胞增殖与细胞周期影响的实验。

1 材料与方法

1.1 细胞株及培养方法 HL60细胞购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，由江西中医药大学基础医学院实验中心保存，将HL60细胞培养于含有10%新生小牛血清的RPMI1640完全培养基中(37℃，5%CO2饱和湿度培养)，培养至细胞处于对数生长期用于后续实验。

1.2 主要试剂 RPMI1640培养基及新生小牛血清为美国GIBCO公司产品;全反式维甲酸(All transretinoic acid，ATRA)、四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、佛波酯(TPA)、碘化丙啶(PI)、RNase A均为美国Sigma公司产品;鼠抗人Cyclin E、CDK2抗体均为美国Santa Cruz公司产品;HRP标记的羊抗鼠IgG二抗、GAPDH内参抗体均为北京中杉金桥公司产品。其余未说明的试剂均为国产分析纯级试剂。

1.3 药物 水蛭原药材购于江西中医药大学附属医院中药房，并经我校中药资源学科组邓可众副教授鉴定且符合国家中药临床应用标准。水蛭用超微粉碎机粉碎，提取物以液氮快速冻融法制备［4］:取水蛭超微粉1.5g置15mL离心管内，加10mL无菌双蒸水制成混悬液，再将离心管置液氮内5min，取出，立即放入37℃水浴中迅速融解，重复3次，再3000r/min离心10min。取上清液过滤，滤液冷冻干燥18h即得水蛭冻干粉，－20℃保存备用，临用前用培养基配成实验所需浓度工作液，再经0.22um无菌滤器正压过滤除菌。

1.4 MTT试验 取对数生长期的HL60细胞以5.0×104/mL细胞浓度置于96孔培养板内培养，同时用水蛭提取物(根据前期实验结果［3］，设 0.7、1.4、2.8g/L，为水蛭提取物冻干粉的剂量)再处理HL60细胞48h，同时设正常对照孔及阳性药物(ATRA)对照，到时间点后各孔加入MTT液20μL/孔，每组10个复孔，4h后终止培养，以1000r/min离心5min，去除上清，加入 DMSO(150 μL/孔)使结晶物溶解，用自动酶标仪波长490nm处测吸光度A值，实验重复5次，得出量效关系。按下列公式计算细胞抑制率:细胞生长抑制率(%)=(对照孔A值－试验孔A值)/对照孔A值×100%。

1.5 FCM检测HL60细胞周期 收集各组细胞，每组细胞数约2.0×106个，离心后弃上清，用冷PBS漂洗，加冷70%乙醇固定，4℃过夜;次日离心后弃乙醇，用PBS漂洗2遍，加入 PI(100ug/mL)10μL、RNase A(5ug/mL)10μL、并加入PBS液至总体积达500μL，于室温下避光作用30min，然后上流式细胞仪(FCM)行细胞周期检测。实验重复10次。

1.6 Western blotting法检测Cyclin E、CDK2 蛋白表达 按照操作说明，用裂解液提取组织总蛋白;BCA法测总蛋白质浓度，8%SDS－PAGE电泳，转至PVDF膜;室温下用5%脱脂奶粉封闭1h;然后加一抗(Cyclin E和 CDK2;均为1∶400浓度)，同时以GAPDH(1∶500)为内参，4℃孵育过夜;次日加入HRP标记的羊抗鼠IgG二抗(1∶500)，室温孵育1h;再用化学发光液在暗室进行曝光显影。实验重复5次。

2 结果

2.1 水蛭提取物对HL60细胞增殖的抑制作用各浓度的水蛭提取物处理HL60细胞48h后，MTT检测结果显示水蛭提取物以剂量依赖性方式抑制HL60细胞增殖，抑制率随水蛭提取物浓度增高而增加。各试验组与正常组比较均有统计学差异(P＜0.05，P ＜0.01)，见表1。

表1 水蛭提取物对HL60细胞增殖的抑制作用(±s，n=50)

表1 水蛭提取物对HL60细胞增殖的抑制作用(±s，n=50)

注:与正常组相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

组别 浓度 吸光度 抑制率(%)－ 0.642 ±0.017 －水蛭提取物组 0.7g/L 0.401 ±0.012* 37.89 1.4g/L 0.285 ±0.011＊＊ 55.46 2.8g/L 0.232 ±0.009＊＊ 63.25 ATRA组正常对照组2umol/L 0.273 ±0.009 57.45

2.2 水蛭提取物对 HL60细胞周期的影响 经FCM分析细胞周期结果显示，水蛭提取物对HL60细胞周期的分布有显著性影响。随药物浓度增高，G1期比例增高，S期比例下降，各药物组与正常对照组的G1/G0期、S期比例比较均有统计学差异(P＜0.05，P ＜0.01);各组 G2期比例变化不大，无统计学差异，见表2、图1。

表2 水蛭提取物对HL60细胞周期的影响(±s，n=50)

表2 水蛭提取物对HL60细胞周期的影响(±s，n=50)

注:与正常组相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

组别 浓度 G1期(%) S期(%) G2/M期(%)－ 34.75±5.38 53.64 ±6.77 11.14±0.89水蛭提取物组 0.7g/L 45.21±8.17* 45.93±4.16* 15.20±1.86 1.4g/L 52.21±6.32＊＊ 40.22±3.60＊＊ 13.26±0.55 2.8g/L 60.58±7.26＊＊ 30.81±4.37＊＊ 10.66±1.21 ATRA组正常对照组2umol/L 62.49±6.45 32.16 ±2.48 14.32±0.99

2.3 水蛭提取物对HL60细胞Cyclin E、CDK2蛋白表达的影响 Western blotting法检测各组细胞Cyclin E、CDK2蛋白表达发现，与正常对照(Control)组相比，水蛭中剂量及高剂量处理的两组HL60细胞其Cyclin E、CDK2蛋白的表达显著降低，且剂量越高，其抑制效果越明显(图2)。

图1 FCM检测各组HL60细胞周期图

图1 Western blotting检测各组细胞Cyclin E、CDK2蛋白表达

3 讨论

水蛭始载于《神农本草经》，有破血、逐瘀、通经等功效，广泛用于心脑血管及血栓性疾病的治疗，水蛭也是肿瘤疾病治疗中常用的一味活血药。现代研究发现水蛭抗肿瘤的主要活性成份有凝血酶抑制剂及蛋白酶抑制剂等，含量中主要是水蛭素、溶纤素等［5］。我们前期研究发现HL60细胞经过72h完成对数生长期，然后达到平台期;水蛭提取物浓度高于0.1mg/mL时对HL60细胞有明显的抑制作用，并呈时间和剂量依赖性，且以48h达最佳药效作用时间;经计算作用HL60细胞48h时的水蛭提取物IC50=1.4mg/mL，故本研究中将水蛭提取物设为 0.7、1.4、2.8g/L(低、中、高剂量)三个剂量作用 HL60 细胞48h时间段进行研究［3］。

我们的实验表明，水蛭提取物有良好的抑制HL60细胞增殖作用，2.8g/L的水蛭提取物抑制HL60细胞增殖率达62.25%。经FCM分析细胞周期结果显示，水蛭提取物对HL60细胞周期的分布有显著性影响，随药物浓度增高，G1期比例增高，S期比例下降，但对G2期比例变化不大，这说明水蛭提取物能阻滞HL60细胞于细胞分裂周期的G1期、阻止进入S期。有研究证实，细胞周期长短主要决定于G1期，G1期阻滞可使细胞周期延长，导致细胞增殖减慢［6］。所以，水蛭提取物具有良好的抑制HL60细胞增殖作用与细胞周期G1期阻滞有关。

细胞周期有两个限制点，分别是G1/S期及G2/M期，其中G1/S期是启动细胞周期的关键，而Cyclin E又是调节细胞周期从G1期向S期过渡的关键因子［7］。CDK2是CDK家族成员之一，可与Cyclin E结合形成功能性复合物，促进细胞周期由G1期向S期过渡，细胞呈现旺盛的增殖能力［8］。笔者运用Western blotting法检测各组细胞Cyclin E、CDK2蛋白表达发现，水蛭提取物能显著降低HL60细胞的Cyclin E、CDK2蛋白表达，且剂量越高，其抑制效果越明显。这就进一步验证了水蛭提取物抑制HL60细胞增殖是将其细胞周期阻滞于G1期，但其详细机制有待深入研究。

［1］周乐，赵文静，常惟智.水蛭的药理作用及临床应用研究进展［J］.中医药信息，2012，29(1):132 －133.

［2］张娟，张媛.浅谈水蛭在肿瘤疾病中的运用［J］.湖南中医杂志，2006，22(4):69.

［3］肖移生，廖夫生，赵志冬，等.水蛭提取物对人白血病HL－60细胞体外抑制作用研究［J］.江西中医学院学报，2013，25(4):63－65.

［4］郭永良，田雪飞，肖竺.水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞体外抑制作用研究［J］.中国中医药信息杂志，2009，16(8):30 －31.

［5］王艳，杨培民，代龙，等.水蛭提取方法及生理活性的研究［J］.中国生化药物杂志，2012，33(1):27 －30.

［6］Swanton C.Cell－ cycle targeted therapies［J］.Lancet Oncol，2004，5(1):27－36.

［7］Siu KT，Rosner MR，Minella AC.An integrated view of cyclin E function and regulation［J］.Cell Cycle，2012，11(1):57 －64.

［8］Sherr CJ，Roberts JM.CDK inhibitors:positive and negative regulators of G1 － phase progression［J］.Genes Dev，1999，13(12):1 501－1 512.