桔梗皂苷对哮喘小鼠气道炎症保护作用的研究

★ 谢轶群 刘华 倪松石 (.如皋市中医院呼吸内科 江苏如皋6500;.南通大学附属医院呼吸内科 江苏 南通6000)

支气管哮喘是临床常见病、多发病和难治病，是世界范围内最常见的呼吸系统疾病之一，全球约有3亿以上的人患哮喘，是世界公认的医学难题，被世界卫生组织列为疾病中四大顽症之一。西医尽管采用了吸入糖皮质激素及支气管舒张剂等药物控制哮喘的急性发作和气道的慢性炎症，但由于治疗周期长、病人依从性差及药物副作用等问题，使其临床应用受到一定的限制。中医中药由于取材方便、价格低廉、副作用少等优点近年来受到临床科研工作者及患者的青睐。桔梗在治疗支气管哮喘的中药复方或汤剂中发挥着重要作用，然而桔梗治疗支气管哮喘的机制并未得到验证。研究者拟通过构建支气管哮喘的动物模型，以地塞米松作为对照药物研究桔梗皂苷对哮喘气道炎症的保护作用，初步揭示桔梗皂苷发挥临床疗效的机制，为其临床应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 动物 BALB/c小鼠32只，清洁级，体重20～25g，雌性。购自中国科学院上海动物中心，动物证号SCXKL(沪)2006－0003。

1.2 试剂 卵白蛋白(OVA)、乙酰胆碱(Ach)、磷酸盐缓冲液(PBS)、地塞米松(均为Sigma公司，美国);桔梗皂苷、IL－4，IL－13试剂盒(均为Bisource公司，美国)。

1.3 仪器 呼吸机及分析系统(北京新奥成科技有限公司);酶标仪(Sunrise，奥地利);S－888E型超声雾化器(南京道芬电子有限公司);荧光倒置显微镜及图像分析系统(Carl Zeiss，德国);动物肺功能体描箱(北京新奥成科技有限公司);真空冻干机(LABCONCO，美国)。

1.4 试验方法 实验方法参照刘华［1］等的方法，将BALB/c小鼠随机分为四组，每组8只。分别为磷酸盐缓冲液(PBS)对照组(A组)，卵白蛋白(ovalbumin，OVA)致敏组(B组)，OVA+桔梗皂苷组(C组)，OVA+地塞米松组(D组)。B、C、D三组小鼠分别于实验起始，第2周末和第3周末腹腔注射OVA和氢氧化铝的混悬液200μL，第4周开始连续10d(每天20min)雾化吸入1%w/v OVA溶液;在此基础上C组和D组小鼠分别予以灌胃桔梗皂苷25mg/kg和以腹腔注射的方式给予DXM5mg/Kg/d，连续10d。对照组小鼠以PBS作为对照。小鼠最后一次干预后一天予以麻醉后检测肺功能及检测灌洗液上清测白介素4，白介素13(IL－4、IL－13)，沉渣行瑞氏－吉姆萨染色做细胞分类和计数，最后处死动物取肺组织做病理形态学检查。

1.4.1 哮喘小鼠气道反应性测定 实验鼠用戊巴比妥钠麻醉后，行气管插管。小鼠尾静脉穿刺，按照下述浓度梯度注入Ach，连接动物肺功能仪，设置参数:呼吸100次/分，潮气量5－6mL/kg处理以不同浓度梯度Ach激发支气管，以其肺阻力(lung resistance RL)表示气道反应性。Ach浓度分别为基线值以及 0.5，1.5，5，15，45g/L。

1.4.2 支气管肺泡灌洗液(BALF)炎症细胞计数小鼠行气管插管，支气管肺泡灌洗，回收率约60%～70%，离心后取上清分装保存待测IL－4、IL－13。沉渣行炎症细胞的分类和计数。

1.4.3 BALF上清液 IL－4、IL－13测定 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)按试剂盒说明书进行。

1.4.4 哮喘小鼠肺组织病理形态学检查 小鼠处死后，取新鲜肺组织酒精固定，制备蜡块，切片后常规苏木精－伊红染色(H＆E)染色。

1.5 统计学分析 应用SPSS 17.0统计学分析软件，对本实验所有数据资料进行分析。实验数据采用均数士标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 哮喘小鼠气道高反应性测定 见表1。

表1 各组小鼠气道阻力比较(±s，n=8)

表1 各组小鼠气道阻力比较(±s，n=8)

注:与A组比较，aP＜0.05;与 B组比较，bP＜0.05;与 C组比较，cP ＞0.05。

组别RL(cmH2O/mL/s)0.5g/L 1.5g/L 5g/L 15g/L 45g/L A 1.10±0.16 1.17 ±0.14 1.22±0.14 2.40±0.20 3.基线30 ±0.56 5.31 ±1.77 B 1.20±0.16 1.26 ±0.90 1.45±0.24 3.76 ±0.43a6.92±0.53a14.88 ±2.59a C 1.20±0.15 1.28 ±0.18 1.33±0.26 1.89±0.45b3.22±0.73b 7.76±1.43b D 1.15±0.18 1.18 ±0.36 1.17±0.35 1.78 ±0.16bc2.34±0.61bc4.56±1.98bc

2.2 BALF炎症细胞的分类和计数 见表2。

表2 各组小鼠BALF中炎症细胞计数比较(×109/L，±s，n=8)

表2 各组小鼠BALF中炎症细胞计数比较(×109/L，±s，n=8)

注:与 A 组比较，aP＜0.05;与 B组比较，bP＜0.05;与 C比较，cP ＞0.05。

组别 嗜酸性粒细胞 中性粒细胞 巨噬细胞 淋巴细胞A 0.89 ±0.16 2.89 ±2.34 16.28 ±1.99 2.25 ±0.74 B 84.25±6.78a 13.65 ±4.89a 21.75±2.45a 16.50 ±2.76a C 16.25 ±6.34b 8.50 ±2.86b 21.34 ±3.70 16.00 ±2.39 D 18.21±3.16bc 5.60 ±2.18bc 17.60±2.32b 4.50±0.95b

2.3 BALF细胞因子IL－4、IL－13检测结果 见表3。

表3 各组小鼠IL－4、IL－13浓度比较(±s，n=8)/pg·mL－1

表3 各组小鼠IL－4、IL－13浓度比较(±s，n=8)/pg·mL－1

注:与A组比较，aP＜0.05;与 B组比较，bP＜0.05;与 C组比较，cP ＞0.05。

组别IL－4 IL－13 A 9.50 ±2.60 8.60 ±2.44 B 48.00 ±5.62a 63.36 ±8.39a 10.32 ±3.78b 11.33 ±2.90b D 11.39 ±3.80bc 28.00 ±5.380 C b

2.4 哮喘小鼠肺组织病理形态学结果 见图1。

图1 各组小鼠肺组织病理形态学结果

3 讨论

支气管哮喘是由多种细胞(如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等)和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病，这种慢性炎症与气道高反应性相关，气道高反应性是指气道对各种特异性或非特异性刺激反应性增高，以气道平滑肌的过早或过强的收缩反应、支气管痉挛、黏液腺体分泌亢进为主要临床表现。

IL－4是B细胞刺激因子，其主要作用是诱导B细胞活化、增殖、分化及IgE的分泌，也可以直接诱导IgM或IgG转化为IgE，IgE是哮喘发病过程中的重要抗体，IgE的过量产生，促使了I型变态反应的发生。IL－4能释放IL－4到细胞外微环境，激活T细胞产生更多的IL－4，能促使肥大细胞的增殖、分化、成熟，激活的肥大细胞，启动炎症细胞募集、趋化［2］。IL－4是早期T细胞诱导炎症反应启动因素，并对嗜酸粒细胞及其他炎症细胞有强大的化学趋化作用，可显著增加气道内炎症细胞的聚集、活化，增强气道高反应性［3］。IL－13与IL－4由相同细胞产生，它们具有共同的信号传导途径，调节途径也相同，有相似的生物学活性，是可以直接促进IgE合成的细胞因子之一［4］。IL－13在所有与哮喘有关的细胞因子中占具重要的地位，可以在没有其他细胞因子的情况下，单独介导引起哮喘。IL－13可引起嗜酸粒细胞聚集，黏液分泌增加，导致气道炎症及气道高反应性，在气道重塑中起着重要作用，是形成气道高反应性所必需的细胞因子。有研究显示，在IL－13缺如时，即使有大量的IL－4、IL－5以及明显的气道嗜酸粒细胞浸润，气道高反应性也不能产生［5］。

本研究通过建立哮喘小鼠模型，应用桔梗皂苷进行干预，探讨其对气道炎症的保护作用及可能机制。结果表明，哮喘小鼠存在嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、IL－4、IL－13表达的上调，桔梗皂苷可抑制哮喘小鼠气道炎症反应，降低气道阻力。抑制嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、IL－4、IL－13的表达可能是其机制之一。但其具体作用机制尚未十分清楚，还需要进一步深入探讨。

［1］刘华.β2肾上腺素能受体减敏及其激素保护作用的蛋白质组学研究［D］.南京:南京医科大学，2008.

［2］Ochi H，Hirani WM，Yuan Q，et al.T helper cell type 2 cytokine －mediated comitogenic responses and CCR3 expression during differentiation of human mast cells in vitro［J］.Exp Med，1999，190(2):267－280.

［3］杨学敏，史孩广，成家军，等.白介素4在支气管哮喘发病机制中的作用及其靶向治疗研究［J］.中华哮喘杂志，2011，5(2):112－116.

［4］范新蕾，田锋，田洪德.白介素与支气管哮喘相关关系的研究进展［J］.临沂医学专科学校学报，2005，27(1):45 －47.

［5］David M，walter JJ，Mcintire GB，et al.Critical role of IL － 13 in the development of allergen－induced airway hyperreactivity［J］.Immunol，2001，167(8):4 668 －4 675.