注射用丹参多酚酸盐无菌检查方法学验证

徐全华，单天炎，李忠辉，张 莹，吴蒙恩

(杭州澳亚生物技术有限公司，浙江杭州 310018)

注射用丹参多酚酸盐具有活血、化瘀、通脉功效，用于冠心病稳定型心绞痛，中医辨证为心血瘀阻证者，症见胸痛、胸闷、心悸［1］。根据《中国药典》2010年版一部无菌检查法的规定，建立药品无菌检查方法时，应该进行方法学验证，以证明方法的适用性［2］。目前，还未见注射用丹参多酚酸盐无菌检查方法学验证的相关资料，为确保该产品检查方法科学、结果准确，本文按中国药品检验标准操作规范建立了注射用丹参多酚酸盐无菌检查方法，并对方法进行了验证［3］。

1 仪器与材料

XG1.DWXD－0.36型脉动真空灭菌器(山东新华医疗器械厂);HTY－Ⅲ型智能集菌仪(杭州泰林生物技术设备有限公司);KDGB220、KDGB330型一次性全封闭集菌培养器(杭州泰林生物技术设备有限公司);LRH－250－Ⅱ型、LRH－250型生化培养箱(广东省医疗器械厂)。

注射用丹参多酚酸盐(规格:100mg，杭州澳亚生物技术有限公司生产，批号:12102325、12102425、12110725)。

试验用菌株:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)［CMCC(B)26 003］;铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)［CMCC(B)10 104］;枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)［CMCC(B)63 501］;生孢梭菌(Clostridium sporogenes)［CMCC(B)64 941］;大肠埃希菌(Escherichia coli)［CMCC(B)44 102］;白色念珠菌(Candida albicans)［CMCC(F)98 001］;黑曲霉(Aspergillus niger)［CMCC(F)98 003］。上述菌种由浙江省食品药品检验所提供。

验证用培养基:硫乙醇酸盐流体培养基;改良马丁培养基;营养肉汤培养基;营养琼脂培养基;玫瑰红钠琼脂培养基;改良马丁琼脂培养基。上述培养基由杭州微生物试剂有限公司提供。

稀释液和冲洗液:0.1%蛋白胨水溶液(杭州澳亚生物技术有限公司质检部配制)。

2 方法与结果

2.1 菌液制备 取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的新鲜培养物，用白金耳接种至营养肉汤培养基中，取生孢梭菌的新鲜培养物，用白金耳接种至硫乙醇酸盐流体培养基中，32.5℃培养24 h。取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，25.5℃培养24 h。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含菌数小于100 cfu的菌悬液。

取黑曲霉斜面的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，25.5℃培养5 d，使大量孢子成熟，加5 mL含0.05%(mL·mL－1)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，用白金耳轻轻将孢子洗脱，用管口带纱布的无菌毛细吸管吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%(mL·mL－1)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠注射液制成每1 mL含孢子数小于100 cfu的孢子悬液。

2.2 菌液计数 分别取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、生孢梭菌各1mL于培养皿中，每种菌做两个平皿，加营养琼脂培养基;取白色念珠菌、黑曲霉菌各1 mL于培养皿中，每种菌做两个平皿，加玫瑰红钠琼脂培养基，按规定条件培养，结果见表1。由表1可知，各菌种在相应的稀释度下，每毫升菌落计数结果符合规定。

表1 微生物计数结果

2.3 培养基的无菌性试验 取硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基各8支，在相应的培养条件下培养14 d，结果见表2(注:“+”代表有菌生长，“—”代表无菌生长，以下表格符号意义相同)。由表2可知，二种培养基的无菌性符合规定。

2.4 培养基的灵敏度试验 取每管装量为12 mL的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100 cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另一支不接种作为空白对照，按相应的条件培养3 d。每管装量为9 mL的改良马丁培养基5支，分别接种小于100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另一支不接种作为空白对照，按相应的条件培养5 d。每天观察记录，结果见表3。由表3可知，培养基的灵敏度试验结果符合规定。

2.5 薄膜过滤法方法学验证［4－8］每批取供试品180支，每支用0.1%蛋白胨缓冲液5 mL溶解，每10支为一组，分成18组，每组使用一个过滤器，其中6组未用冲洗液冲洗，另6组冲洗量为100 mL，再6组冲洗量为300 mL，在最后一次冲洗液中加入每1 mL小于100 cfu的试验菌1 mL，过滤后，将相应的培养基100 mL加至各滤筒内作为供试品阳性对照(PPC)。另取集菌培养器，不过滤供试品，其它操作同上，作为阳性对照(PC)。按规定温度培养3～5 d，各试验菌同法操作，结果见表4、表5、表6。由表4～表6可知，三批产品在设定冲洗量为未冲洗、100 mL和300 mL条件下，对6种菌株而言供试品阳性对照和阳性对照均生长良好，并且无明显差异，均无抑菌作用，因此，确定该产品无菌检查方法为:取本品，用0.1%蛋白胨水溶液溶解，采用薄膜过滤法过滤，无需经冲洗液冲洗，直接加相应的培养基培养。

2.6 样品的无菌检查 每批取供试品30支，每支用0.1%蛋白胨水溶液5 mL溶解，取三联管全封闭集菌培养器直接过滤，其中一管加入100 mL硫乙醇酸盐流体培养基，另一管加入100 mL改良马丁培养基，第三管加入100 mL硫乙醇酸盐流体培养基并接种小于100 cfu的金黄色葡萄球菌菌液作供试品阳性对照，另取稀释液，同法操作，作为阴性对照，按规定温度培养14 d，结果见表7。由表7可知，三批产品按验证确定的方法进行检查，供试品阳性对照和阴性对照均成立，产品符合无菌要求。

表2 培养基的无菌性检查结果

表3 培养基的灵敏度试验结果

表4 注射用丹参多酚酸盐方法学验证结果(批号:12102325)

表5 注射用丹参多酚酸盐方法学验证结果(批号:12102425)

表6 注射用丹参多酚酸盐方法学验证结果(批号:12110725)

表7 样品无菌检查试验结果

3 讨论

根据《中国药典》二部附录Ⅺ无菌检查法的要求，无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法，只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法，因此，本品采用薄膜过滤法进行了相应的研究。此外，由于注射用丹参多酚酸盐为非抗菌药物，因此，选择金黄色葡萄球菌作阳性对照菌。研究结果表明:注射用丹参多酚酸盐在试验菌液计数及所用培养基无菌性、灵敏度符合规定条件下，三批产品未经冲洗、以及冲洗量为100 mL和300 mL三组之间供试品阳性对照组生长情况与阳性对照组生长情况一致，表明该产品无抑菌和干扰作用。三批样品经检查，符合无菌要求。因此，确定该产品无菌检查方法为:取本品30支，每支用0.1%蛋白胨水溶液5 mL溶解，用薄膜过滤法处理后，依法检查，应符合规定。通过上述验证所建立的方法可用于注射用丹参多酚酸盐的无菌检查，结果准确、可靠。

［1］ 宋燕青，徐向阳，孙仁弟.注射用丹参多酚酸盐的临床应用概述［J］.药物流行病学杂志，2012，21(8):404 －406.

［2］ 国家药典委员会.中国药典:一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:附录76 －79.

［3］ 中国药品生物制品检定所，中国药品检验总所.中国药品检验标准操作规范［M］.北京:中国医药科技出版社，2010:337－351.

［4］ 陈晓宁.注射用七叶皂苷钠无菌检查方法学验证［J］.中国医药导报，2011，8(1):48 －49.

［5］ 许 威，李 翔.氟罗沙星注射液无菌检查方法的探讨［J］.安徽医药，2011，15(10):1228 －1229.

［6］ 江志杰，高 春.三种中药注射剂无菌检查方法的建立和结果评价［J］.中国现代药物应用，2013，7(3):15 －17.

［7］ 闵 红，裴小龙，杨晓莉.三种规格注射用头孢地嗪钠无菌方法学验证［J］.安徽医药，2013，17(5):764 －766.

［8］ 吴 炜.羟乙基淀粉(200/0.5)乳酸钠林格注射液无菌检查方法学验证［J］.安徽医药，2013，17(8):1300 －1302.