补阳还五汤对大鼠断肢再植术后肢体缺血再灌注损伤的影响*

张辉 袁治国 邵建军

（甘肃省第二人民医院骨科 兰州730000）

断肢（指）再植是指失去血液供应的离断肢体，通过手外科与显微外科手术重建其血液循环使肢（指）体获得再生的手术[1]。断肢再植术后常可引起肢体缺血-再灌注损伤[2]，如何减轻肢体缺血再灌注的损伤，降低肢体缺血再灌注后的致残率和死亡率逐渐成为研究的热点，而中药对肢体缺血-再灌注损伤保护作用的研究也愈来愈受到重视。本研究以名方补阳还五汤为基础，建立大鼠下肢断肢再植术后缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injure，IRI）动物模型，再灌注即刻给予补阳还五汤灌胃，初步探讨补阳还五汤对大鼠下肢缺血-再灌注损伤中的影响，评估其对缺血组织的保护作用及机制，为进一步开展临床上应用补阳还五汤防治肢体缺血-再灌注损伤奠定基础。现报道如下：

1 材料

1.1 实验动物 成年健康清洁级SD大鼠，雄性，体重250～320 g，由甘肃中医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK2012-0106-0001418。

1.2 药品与试剂 补阳还五汤（甘肃省第二人民医院药剂科配置）；超氧化物歧化酶（SOD）测试盒、丙二醛（MDA）测定试剂盒、一氧化氮试剂盒（南京建成生物工程研究所生产，批号：20070605、20070606、20071228）；戊巴比妥钠粉剂（国药集团化学试剂有限公司，批号：20060401）；M-MLv 逆转录酶（Promega公司提供）；Trizol试剂、耐热 DNA聚合酶及DNAMaker（天根生化科技〈北京〉有限公司提供）；PCR引物（武汉博士德生物工程有限公司提供）。

1.3 主要仪器 SpectraMax190酶标仪，Molecular Devices，美国；TDZ4-WS低速台式离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；756MC紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；FA1004天平（上海精科天平厂）；原子吸收分光光度计（北京瑞利分析仪器公司，型号：UV-9100）；低温高速离心机（eppendorf公司，5415R型）；光学显微镜、摄像头（Olympus BX41，SPOT-CCD，diagnostic公司）；透射电镜（荷兰菲利浦，TECNAL-10）；PCR扩增仪（eppendorf公司出品）；Versa Doc 5000Mp成像系统（BIO-RAD公司出品）。

2 方法

2.1 肢体缺血-再灌注损伤动物模型的建立 健康Wistar大鼠术前常规禁食12 h，自由饮水。3%戊巴比妥钠（事先用蒸馏水和戊巴比妥钠粉剂配制）30 mg/kg腹腔内注射麻醉，将大鼠仰卧固定于操作台上，在后肢股三角处剪毛，于腹股沟处沿血管走行纵行切开皮肤、皮下组织，钝性分离缝匠肌后部，游离股动脉、股静脉和股神经，迅速切断动、静脉，在股动、静脉近端分别用动、静脉夹夹闭，并用张力带于股鞘下环绑扎肢体阻断侧支循环。4|h后行血管吻合，断肢再植，恢复血流灌注4 h，后肢颜色恢复红润，制成缺血-再灌注模型。

2.2 动物分组及给药 健康Wistar大鼠120只，随机分为四组，每组30只：（1）正常对照组（A组），仅麻醉及生理盐水灌胃；（2）补阳还五汤组（B组），缺血4 h后行血管吻合，断肢再植，补阳还五汤灌胃；（3）依达拉奉组（C组），缺血4 h后行血管吻合，断肢再植，血栓通注射液灌胃；（4）空白对照组（D组），缺血4 h后行血管吻合，断肢再植，生理盐水灌胃。

2.3 指标的测定 （1）血液标本的采集：每组选10只造模成功的大鼠，分别于再灌注4 h后处死，做中下腹正中切口，暴露下腔静脉用皮试针头穿刺，自下腔静脉取静脉血约2～3 mL，分离血清，测定血清中MPO、LDH、tNOS、iNOS、cNOS、SOD 的 活 性 和MDA、NO及Ca2+的含量。（2）腓肠肌标本的采集：每组大鼠分别取后肢腓肠肌组织后取约200 mg入冻存管低温保存，测Ca2+负载；约200 mg胖肠肌组织用冰生理盐水冲洗后低温保存经后续处理，测SOD活性及MDA浓度；50～100 mg入经DEPC水处理并灭菌的冻存管放入液氮中保存，做RT-PCR。每只大鼠顺肌纤维方向切下大小约为0.1 cm×0.1 cm×0.3 cm的肌肉标本2～3块，用牙签小心移入装有预冷2.5%戊二醛的标本瓶内，4℃冷藏，经后续处理后透射电镜观察。余下部分用10%中性多聚甲醛固定，经后续处理后普通光镜观察。（3）腓肠肌组织提取总RNA，采用RT-PCR半定量分析Bcl-2 mRNA和Bax-mRNA转录水平。（4）通过石蜡切片及HE染色、电镜观察腓肠肌组织形态学变化。

2.4 统计学处理 以SPSS15.0统计软件包进行统计分析，所有数据均以（±S）表示，组间样本均数比较采用单因素方差分析，P＜0.05为有显著统计学意义。

3 结果

3.1 肢体成活情况 再灌注1周后，观察再植术后肢体成活情况。补阳还五汤组20只大鼠，肢体全部成活，成活率100%；空白对照组20只大鼠，术后有6只大鼠逐渐出现肢体坏死，成活14只，成活率70%；提示补阳还五汤组肢体成活率明显增高（P＜0.01）。依达拉奉组成活18只，成活率90%，与补阳还五汤组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

3.2 血清 MPO、LDH 和 NOS（tNOS、iNOS、cNOS）指标变化 再灌注4 h后，与正常组比较，补阳还五汤组、依达拉奉组血清中MPO、LDH、tNOS、iNOS的活性均增高（P＜0.01），空白对照组中血清中cNOS活性降低（P＜0.05），补阳还五汤组血清中cNOS活性增高（P＜0.05）。与空白对照组相比较，补阳还五汤组血清中 MPO、LDH、iNOS活性均降低（P＜0.05），tNOS、cNOS 活性增高（P＜0.05）。见表1。

表1 血清MPO、LDH和 NOS（tNOS、iNOS、cNOS）指标变化比较 （±S） （U/L）

表1 血清MPO、LDH和 NOS（tNOS、iNOS、cNOS）指标变化比较 （±S） （U/L）

注：与 A 组比较，*P＜0.01，△P＜0.05；与 D 组比较，#P＜0.05。

组别 MPO LDH tNOS iNOS cNOS A组B组C组D组47.56±4.24 70.13±7.28*#113.23±6.12*213.59±5.18 3 548.87±239.16 4 602.18±342.13*#5 261.87±142.24*6 128.71±428.13 21.18±5.32 30.12±4.28*#29.32±6.15*23.49±4.58 7.26±2.01 8.96±1.12*#10.21±3.21*13.17±1.30 13.73±2.87 19.41±2.94△#20.17±3.21△#10.32±4.82△

3.3 各组SOD、NO、MDA、Ca2+浓度测定 下肢再植术后4 h，与空白对照组相比，其余三组血清中SOD活性、NO、MDA含量均明显降低（P＜0.01），钙负载水平较低（P＜0.01）。与C组相比，补阳还五汤组能有效降低血清中SOD、NO、Ca2+含量，MDA含量差别无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组SOD、NO、MDA、Ca2+浓度比较 （±S）

表2 各组SOD、NO、MDA、Ca2+浓度比较 （±S）

注：与D组比较，*P＜0.01；与C组比较，#P＜0.05。

组别SOD（U/mg）NO（μmol/L）MDA（nmol/g）Ca2+（mg/kg）A组B组C组D组1.08±0.1*1.60±0.2*#1.65±0.4*1.96±0.8 21.04±5.4*68.92±16.3*#76.51±11.2*108.84±14.1 23.33±6.2*53.22±9.4*53.19±6.8*97.31±19.6 8.26±1.6*158.46±18.2 164.19±13.2 211.33±53.4*#*

3.4 RT-PCR结果 肢体缺血可导致骨骼肌Bcl-2基因表达、Bcl-2/Bax的比值降低，Bax基因表达增高；再灌注后Bcl-2基因表达、Bcl-2/Bax的比值进一步降低，Bax基因表达进一步增高；应用补阳还五汤后，Bcl-2基因表达、Bcl-2/Bax的比值与对照组比明显增加，Bax基因表达与对照组比则明显下降。见表3。

表3 Bcl-2、Bax、β-actin基因RT-PCR产物电泳条带光强度值比值比较 （±S）

表3 Bcl-2、Bax、β-actin基因RT-PCR产物电泳条带光强度值比值比较 （±S）

项目 A组 B组 C组 D组Bcl-2/β-actin Bax/β-actin Bcl-2/Bax 1.8171±0.0638 1.2143±0.0451 1.4964±0.0312 1.6536±0.0102 1.6788±0.1004 0.9850±0.0120 1.7453±0.0115 1.6963±0.0378 1.0289±0.0415 0.8918±0.1102 2.8358±0.2172 0.3145±0.0072

3.5 大鼠下肢缺血再灌注4 h后骨骼肌HE染色光镜下结构的变化 正常的骨骼肌肌纤维粗细均匀，排列整齐；缺血后肌纤维水肿，排列不整齐，部分溶解，并可见有少量白细胞与红细胞渗出；再灌注后肌纤维出现水肿变性、断裂甚至溶解，肌细胞严重破坏，断裂肌纤维间有大量白细胞和红细胞浸润；给药后缺血再灌注组骨骼肌水肿明显减轻，肌纤维变性较对照组为轻，炎性细胞浸润不明显。

4 讨论

各种原因造成的肢体缺血是血管外科和创伤外科常见的病理生理过程，恢复缺血肢体的血液供应是肢体得以存活和保持功能的关键，但缺血组织再灌注又可导致缺血组织的进一步损伤，称为缺血-再灌注损伤[3～4]。组织损伤可进一步引发远隔器官的损伤，进一步发展可演变成全身炎性反应综合征，甚至多器官功能衰竭，危及生命。缺血-再灌注损伤的概念最早由Mccord[5]于1985提出，到目前为止，学者们已经在多种组织、器官中发现再灌注损伤的存在[6～7]。如何能消除再灌注损伤，进一步减少组织损伤、保护细胞功能和避免缺血坏死区扩大已经越来越引起学者们的关注。

补阳还五汤始载于《医林改错》，由王清任所创，大补元气兼以活血，使亏损之五成元气恢复，是谓“还五”，而阳气重新周行全身回复“十全”，故王氏称此方为“补阳还五汤”[8]。方由黄芪、当归、芍药、川芎、桃仁、红花、地龙7味组成，本方各药合用，使气足以推动血行，瘀去络通，则筋肉得养，痿废可愈。现代医学研究表明[9]，本方功能广泛，可抑制血小板聚集、抗血栓形成或溶血栓；扩张血管、增加血流量；改善血液流变性和微循环；增加心肌营养性并有强心作用；对急性缺血损伤有预防作用；对神经损伤有修复作用；可降血脂和抑制动脉粥样硬化斑块形成；耐缺氧和抗疲劳、抗炎并可提高免疫功能。

氧自由基主要是指超氧阴离子（O2-）和羟自由基（OH-）。多数学者认为氧自由基是造成缺血-再灌注损伤的重要因素，认为氧自由基是缺血再灌注损伤的重要发病环节[10]。氧自由基对细胞的主要损害是造成脂质过氧化，其代谢产物为MDA，通过测定MDA的含量，能够反映氧自由基的代谢及脂质过氧化对机体的损伤程度。NO本身就是一种自由基性质的物质，在再灌注损伤中，由于细胞内钙超载，可激活一氧化氮合酶（NOS），使NO增加，NO与O2反应生成NO2，可使SOD的酪氨酸硝基化，从而使缺血后细胞溃变[11]。缺血时ATP生成减少，细胞Na+-Ca2+交换增加，再灌后恢复了能量供应和ATP值，促进Na+-Ca2+交换，使细胞外钙大量内流，造成细胞内钙超载，Ca2+浓度升高可激活多种磷脂酶，促进蛋白质分解酶合成增加、血小板活化因子合成增加；激活磷脂酶促进膜磷脂的分解，破坏细胞和线粒体膜及促进氧自由基形成，造成细胞严重损伤[12]。当肢体缺血达到一定程度，骨胳肌细胞受到损伤，细胞水肿，细胞膜通透性增高，细胞内含有的大量LDH入血，因而血中LDH活性变化可作为缺血后骨骼肌损伤的指标[13]。Bcl-2和Bax对细胞凋亡的调控，不仅取决于自身表达水平的高低，还与Bcl-2/Bax的比值有关，比值增加，细胞趋于存活，反之则导致细胞凋亡[14]。依达拉奉是一种作用机理明确的新型的自由基清除剂[15]，主要通过提供电子直接清除羟自由基（OH-），抑制自由基的生成及细胞膜过氧化连锁反应，有效地抑制氧自由基对机体造成的损伤，抑制细胞凋亡。依达拉奉在缺血再灌注早期通过清除过多的羟自由基，有效地提高SOD的活性，降低MDA、MPO。抑制血管内细胞遭受氧自由基的损伤，减轻血管通透性，减少间质水肿、间质血管扩张以及炎性细胞因子的释放，从而保护肌组织灌注正常和软骨组织未发生退行性改变[16]。

本课题以依达拉奉作为对照组，研究结果表明：补阳还五汤能有效降低肢体缺血-再灌注后氧自由基产生，增强SOD活性，减轻有钙超载所导致肢体缺血-再灌注损伤；能够减少血浆NO的生成；改善微循环，扩张血管，抗血小板聚集，抗血栓形成；降低钙超载，减轻内皮细胞损害。显著改善大鼠缺血再灌注后肢体修复状况，并明显提高断肢再植成活率，抑制大鼠血清LDH活性的升高，减少血清MDA水平。通过增强抗凋亡基因Bcl-2的表达和减弱促凋亡基因Bax表达来抑制肢体缺血再灌注后骨骼肌细胞的凋亡，减轻肢体缺血-再灌注损伤。光镜下观察肢体缺血再灌注后骨骼肌HE图像，可以看到骨骼肌组织在缺血后出现肌纤维水肿，炎性细胞浸润；再灌注后组织水肿加重，大量的炎性细胞浸润，出现肌纤维断裂、变性、溶解；而经补阳还五汤处理后的骨骼肌图像肌纤维水肿、变性、炎性细胞浸润都相对缺血组和再灌注组减轻。透射电镜结果可见，肢体在缺血和再灌注后，肌纤维细胞凋亡程度逐渐加重，而给药后肌纤维细胞凋亡均较对照组为轻，这也支持Bcl-2、Bax基因RT-PCR的结果，说明补阳还五汤能够改善肢体缺血再灌注后骨骼肌损伤程度。

综上所述，补阳还五汤对大鼠断肢再植术后肢体缺血-再灌注损伤具有明显的保护作用，通过抗氧化、清除自由基、抑制骨骼肌细胞凋亡来达到对缺血再灌注后损伤骨骼肌的改善保护作用。本课题的不足在于目前尚无疗效确切的单味西药作为临床对照；没有对再植术后成活肢体的功能进行评定，补阳还五汤在术后肢体功能重建中的保护、修复作用尚需进一步研究。

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