光动力学疗法的抑瘤作用和免疫效应的实验研究

徐静 孙新梅 陶露

光动力学疗法的抑瘤作用和免疫效应的实验研究

徐静1孙新梅2陶露1

目的探讨光动力学疗法（PDT）抑瘤效应的免疫机理，以及PDT联合肿瘤局部注射卡介苗（BCG）的治疗效果。方法建立小鼠Heps肝癌移植瘤模型96只，随机分为对照组、PDT组、BCG组和联合组。观测各组移植瘤体积的变化。采用酶联免疫吸附实验（ELISA），测定各组荷瘤小鼠血清中白细胞介素（interleukin，IL）-1β的变化。结果（1）各治疗组治疗后7 d的移植瘤体积较对照组均明显缩小（P ＜0.01）。联合组治疗后7 d的肿瘤体积较单纯PDT组明显缩小（P ＜0.05）。（2）ELISA结果显示，PDT组和联合组治疗后2 h、24 h以及7 d荷瘤小鼠血清中IL-1β的含量，均高于对照组和BCG组（P ＜0.01）。联合组治疗后2 h、24 h以及7 d荷瘤小鼠血清中IL-1β的含量，超过单纯PDT组（P＜0.05）。结论结果显示PDT对强化荷瘤宿主免疫力有显著作用。使肝癌移植瘤体积明显缩小。PDT联合局部注射BCG的治疗方法的疗效优于单用PDT和单用BCG。

Heps肝癌细胞株；光动力学疗法；卡介苗；细胞因子；小鼠

光动力学疗法（photodynamic therapy，简称PDT）是运用激光激活能于肿瘤组织中富集并且可长时间潴留的药物（主要是光敏物质）而产生协同效应杀伤肿瘤细胞的治疗方法。PDT已经普及到各类恶性肿瘤的姑息治疗等应用中，但其作用机制亦仍未完全阐明。已有研究成果表明，特定的免疫效应的产生对恶性肿瘤的遏制发挥了显著治疗效用，而该种免疫效应正是由存在于宿主内的PDT激活引起的[1-2]。本文主要借助对小鼠肝癌移植瘤在PDT前后不同发展现象的分析，对小鼠血清中细胞因子数量的增减现象的观察，研究PDT在治疗肿瘤方面的基本原理。

1 实验材料与方法

1.1 实验所需材料

1.1.1 实验动物对象 徐州医学院实验动物中心提供的ICR小鼠，数量共计96只。小鼠均为8～10周龄的雄性，体重为20 g，误差±2 g。

1.1.2 实验肿瘤对象 由中国科学院上海药物研究所提供的瘤株小鼠Heps肝癌细胞株（瘤源腹水保种）。此型细胞株已经江苏省肿瘤防治研究所传代保种。

1.1.3 实验仪器 东南大学提供的HDJ-500型高功率氦氖蒸汽激光器。输出端接内径400 µm的石英导光纤维，输出红光的中心波长为632.8 nm。实验用光敏剂为第二军医大学提供的癌光啉（Photocarcinorin，PSD-007）注射液。

1.1.4 其余实验所需 上海生物制品研究所提供的试剂卡介苗（Bacillus Calmette Guerin，BCG）。实验用试剂盒为上海晶美公司提供的小鼠白介素（interleukin，IL）-1β酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。

1.2 实验主要方法

1.2.1 小鼠移植性Heps实体瘤模型的建立无菌操作取传代保种8 d、生长旺盛且无破溃的Heps荷瘤小鼠的腹水，台盼蓝拒染活细胞记数法计数，活瘤细胞超过90%。用生理盐水注射液按1：3～5的比例制成肿瘤细胞悬液，计数并调节细胞浓度为1×107/ml，取0.2 ml接种于ICR小鼠右后背侧皮下。

1.2.2 分组接种肿瘤后第7 d，待移植瘤长至直径0.8～1.2 cm时，将模型鼠随机分为4组，每组均24只小鼠。（1）光动力学疗法（PDT）组：肿瘤局部进行光动力学治疗；（2）联合（PDT＋BCG）组：于PDT后即时行肿瘤局部注射BCG 1×107CFU[2]；（3）BCG组：肿瘤局部注射BCG1×107CFU，；（4）对照（C）组：未进行任何处理。

1.2.3 PDT方法照光前每只小鼠尾静脉注入PSD-007 20 mg/kg体重，避光7 h。8%硫化钠肿瘤局部脱毛，暴露照光区。腹腔内注射2%戊巴比妥钠40 mg/kg体重，麻醉后小鼠侧卧于照射板上，红光照射肿瘤局部。调整光斑直径2 cm，平切光纤头距肿瘤3 cm。功率密度190～200 mW/cm2，能量密度170～180 J/cm2。

1.2.4 肿瘤体积瘤结节长出后隔日用游标卡尺测量瘤体长径（a）和瘤体的横径（b），按公式肿瘤体积计算，比较各组肿瘤的生长情况。

1.2.5 ELISA测定各组荷瘤小鼠血清中细胞因子的含量各组于治疗后2 h、24 h以及7 d分批取6只小鼠，摘眼球取血，分离血清后，按ELISA试剂盒说明书测定血清中细胞因子IL-1β的浓度。

1.3 统计学处理

数据均为计量资料，实验数据以（均数±标准差）表示，采用SPSS 12.0统计软件对实验数据进行统计学处理。两样本均数间的比较采用t检验，多个样本均数间的比较采用q检验。P＜0.05认为差异有统计学意义，P＜0.01认为有显著差异。

2 结果

2.1 小鼠Heps肝癌移植瘤对不同治疗的反应以及瘤体的消长情况

PDT组和联合组光照后2 h瘤体表面充血发红；光照后24 h瘤体表面变黑，部分瘤体表面结痂；光照后7 d，瘤体表面结痂部分脱落，肉眼见瘤体退缩。其中联合组肿瘤体积的缩小较单纯PDT组更为迅速而明显。BCG组随移植后的时间延长，肿瘤体积逐渐增大，但其增长速度较对照组明显减慢。

图1 IL-1β标准曲线

表1 各治疗组移植瘤体积的变化[cm3，（±s），n=24]

表1 各治疗组移植瘤体积的变化[cm3，（±s），n=24]

注：#与对照组和BCG组相比，P＜0.01；*与对照组相比，P＜0.01；▲与PDT组相比，P＜0.05

治疗后2 h 24 h 7 d对照组 0.45±0.02 0.45±0.02 0.77±0.11 2.41±0.39 PDT组 0.47±0.05 0.47±0.05 0.58±0.07 0.43±0.05#BCG组 0.47±0.07 0.47±0.07 0.69±0.11 1.68±0.24* PDT＋ 0.51±0.03 0.51±0.03 0.63±0.03 0.33±0.07#▲BCG组组别 治疗前

表2 荷瘤小鼠治疗后血清中IL-1β的变化[pg/ml，（±s）]

表2 荷瘤小鼠治疗后血清中IL-1β的变化[pg/ml，（±s）]

注：#与C组相比，P＜0.01，▲与BCG组相比，P＜0.01，*与PDT组相比，P＜0.05

组别 治疗后 IL-1β C组 2 h 30.50±6.28 24 h 25.61±3.75 7 d 25.03±3.01 BCG组 2 h 61.85±7.72#24 h 97.25±9.83#7 d 48.08±6.46#PDT组 2 h 210.53±17.05#▲24 h 415.45±25.35#▲7 d 219.35±17.16#▲PDT＋BCG组 2 h 243.77±18.42#▲24 h 534.52±28.52#▲* 7 d 316.27±16.64#▲*

各组小鼠治疗前和治疗后的移植瘤体积见表1。PDT组、联合组以及BCG组治疗后7 d的肿瘤体积较对照组均明显缩小（P ＜0.01），PDT组、联合组治疗后7 d的肿瘤体积较BCG组均明显缩小（P＜0.01），联合组治疗后7 d的肿瘤体积较单纯PDT组缩小（P＜0.05）。

2.2 荷瘤小鼠血清细胞因子IL-1β检测结果

根据测得的各组OD值、标准曲线，见图1，以及各组待测血清样本稀释倍数，计算得到各组荷瘤小鼠血清中IL-1β浓度，结果见表2。PDT后不同时间，血清中IL-1β的含量均有不同程度的增高。以治疗后不同时间点为横坐标，血清中细胞因子TNF-α的浓度为纵坐标，把各组荷瘤小鼠治疗后不同时间点血清中IL-1β浓度绘成直方图，见图2。

图2 各组IL-1β浓度的三维柱形图（以各组均数表示）

3 讨论

根据已有研究实验研究成果判断，PDT在针对性杀治肿瘤细胞和破坏肿瘤微血管方面具有明显作用，同时能够有效激发存留于宿主内的抗肿瘤免疫效应，新的研究成果已经证明由此产生的免疫作用对遏制肿瘤发挥了积极作用。实验结果显示PDT在破坏肿瘤细胞、杀伤肿瘤微血管和肿瘤间质的同时，能够造成几种特定免疫分子数量的改变，从而引起不同的整体和局部性反应。Seyo等在文献[3]中对膀胱癌患者实施PDT以后，IL-1β从尿液中被检出，在一定程度上提供了IL-1β分子是由PDT过程所激发产生的证据。

本实验结果显示，PDT后2 h、24 h以及7 d，荷瘤小鼠血清中IL-1β的含量均有不同程度的增高。这提示：PDT后，光毒性损伤诱导了荷瘤小鼠体内大量释放细胞因子IL-1β。

IL-1β被称为前炎症细胞因子（proinflammatory cytokine），是启动炎症反应的关键细胞因子[4]，可进一步介导巨噬细胞和中性粒细胞向肿瘤部位浸润，实现免疫应答反应的正反馈。PDT后，荷瘤小鼠血清中IL-1β的水平高于荷瘤对照组，说明PDT能够促进荷瘤小鼠分泌细胞因子IL-1β，从而提高荷瘤小鼠免疫效应，促进抗肿瘤效用。

采取结合各种治疗手段的综合疗法是被现代医学界普遍承认的治疗肿瘤的可行方法，也符合目前癌症治疗研究的新趋势。PDT虽然在抗癌抑癌方面有一定疗效，但是限于局部疗法受制于穿透深度的限制，治疗作用在遇到大型瘤体或者浸润过深的实体瘤体时发挥有限。为了强化PDT的治疗效果，部分研究者将手术、化疗、放疗等医学方法与PDT相结合[5-7]，意图提高PDT的治疗范围，从而将综合治疗方法的疗效发挥到更高的水平。随着现代医学在肿瘤治疗的快速进步，融合了PDT疗法和免疫疗法各自优势的光动力免疫疗法（photodynamic immunotherapy，PDIT）逐渐扩大应用，在医学界引起了广泛关注[8]。

TNF-α是一种对多种肿瘤细胞都有突出治疗效用的制剂，大量的研究已经发现，将诱导单核细胞分泌的TNF-α免疫制剂与PDT疗法联合应用，能有效杀伤和抑制肿瘤细胞的发展和生成，产生的更强的协同治疗效果。David等在文献[9]中研究双低剂量的二甲基磺醌醋酸（5，6-dimethylxanthenone-4-acetic acid，DMXAA）和PDT的协同效应时得出，正常组织的损伤程度、肿瘤复发率呈明显下降趋势的结果，而用于抑制血管生成的细胞因子DMXAA正是激发TNF-α的源头。

本实验所用的免疫佐剂是已经在医学界得到大范围应用的BCG，它的主要用途为减毒活疫苗。1935年，自Sweden的Holmgree首次用BCG治疗癌症算起，到上世纪60年代，BCG通过不断发展已经成为一种成熟的治疗癌症的方法。本文实验中BCG组荷瘤小鼠血清中的TNF-α数量发生了明显增高，提示BCG可诱导巨噬细胞产生TNF-α免疫制剂。

实验组中BCG＋PDT协同治疗法对小鼠肝癌移植瘤进行治疗，结果显示与单纯PDT组相比，BCG+PDT协同组的肿瘤体积发生了显著减小，荷瘤小鼠血清中TNF-α浓度比PDT组有显著提高。这提示了局部注射BCG和PDT的综合疗法能增强TNF-α的产生数量，而从强化治疗肿瘤病变效果。

由实验结果可以看出，荷瘤小鼠肝癌移植瘤的体积在实施PDT后发生显著减小，血清TNF-α浓度得到提高，提示实施PDT以后在原发灶被大范围杀伤，机体免疫力获得提升。加入注射BCG之后，TNF-α浓度比PDT组中有了显著提高，提示PDIT的治疗效应要优于单纯PDT，荷瘤宿主免疫力获得大幅提高，在一定程度上验证了肝癌综合疗法的优越性。在下一步的临床应用中要注意加强研究，为优化PDT治疗方法提供更多更有效的抗癌和肿瘤抑制手段。

[1]Dougherty TJ，Gomer CJ，Henderson BW，et al. Photodynamic Therapy[J]. Journal of the National Cancer Institute，1998，90（12）：889-905．

[2]Korbelik M，Sun J，Posakony JJ. Interaction between photodynamic therapy and BCG immunotherapy responsible for the reduced recurrence of treated mouse tumor[J]. PhotochemPhotobiol，2001，73（4）：403-409．

[3]Nseyo UO，Whalen RK，Duncan MR，et al. Urinary cytokines following photodynamic therapy for bladder cancer. A preliminary report[J]. Urology，1990，36（2）：167-171．

[4]陈慰峰. 医学免疫学[M]. 北京：人民卫生出版社，2001：45-356．

[5]Yom SS，Busch TM，Friedberg JS，et al. Elevated serum cytokine levels in mesothlioma patients who have undergone pleurectomy or extra pleural pneumonectomy and adjuvant intraoperative photodynamic therapy[J]. PhotochemPhotobiol，2003，78（1）：75-82．

[6]张南征，李吉华，邵艾莉，等. 与局部化疗联合治疗上消化道肿瘤的疗效观察[J]. 中国激光医学杂志，1994，3（2）：91-93．

[7]Zhang NZ，Zhu Y，Pan W，et al. Photodynamic therapy combined with local chemotherapy for treatment of advanced esophagocardiac carcinoma[J]. Photodiagnosis and photodynamic therapy，2007，4（1）：60-64．

[8]周传农，谢树森，李晖. 光动力免疫治疗-肿瘤治疗新探索[J].中国激光医学杂志，2000（9）：196.

[9]Bellnier DA，Gollnick SO，Camacho SH，et al．Treatment with the tumor necrosis factor-inducing drug 5, 6-dimethylxanthenone-4-acetic acid enhances the antitumor activity of the photodynamic therapy of RIF-1 mouse tumors[J]. Cancer Res.，2003，63（22）：7584-7590.

Experimental Studies on Photodynamic Therapy’s Effect

XU Jing1SUN Xinmei2TAO Lu1, 1 Outpatient department, Clinic of Air Force Logistics College, Xuzhou 221000, China, 2 Outpatient department, Clinic of Troop 95958, Shanghai 200120, China

ObjectiveTo invest the local immune effect of photodynamic therapy (PDT) and the effect of PDT combined with local injection of BCG.Methods96 tumor-bearing models were established with liver carcinomas subcutaneously transplanted in mice. The mice were divided randomly into four groups: control group, PDT group, BCG group, and PDT plus BCG group. Tumor size was measured in each group. IL-1β was measured with enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) kit.Results(1) The tumor volume of PDT group, BCG group, and PDT plus BCG group was smaller than that of the control group on the 7 days after therapy (P＜0.01). The tumor volume of PDT plus BCG group was smaller than that of the PDT group on the 7 days (P＜0.05). (2) At 2 hours, 24 hours and 7 days after therapy, ELISA results showed that compared with control group and immune therapy only group, the abilities of PDT group and PDIT group to secrete cell factors IL-1β increased obviously. And there was statistic significance (P＜0.01). At 24 hours and 7 days after therapy, ELISA results showed that compared with PDT only group, the abilities of PDIT group to secrete cell factors IL-1β increased obviously. And there was statistic significance (P＜0.05).ConclusionPDT had the inhibitory effect on tumor growth of mice Heps cell line, and spontaneously could induce the systemic immune effects. The therapeutic effects of PDT combined with BCG were superior to PDT only and BCG only.

Heps liver cell line, Photodynamic therapy, Bacillus calmette guerin, Cell factors, Mouse

R730.5

A

1674-9308（2015）32-0204-04

10.3969/j.issn.1674-9308.2015.32.152

1 221000徐州，空军勤务学院门诊部；2 200120上海，95958部队门诊部