三峡库区乌皮香核桃隔膜粗多糖的提取及抗氧化活性

陈 林，汪开拓，王兆丹，吴应梅，张成庭，曲留柱

重庆三峡学院生命科学与工程学院 生物与食品基础实验教学中心(市级实验教学示范中心)，万州 404100

核桃隔膜中医又称分心木(Diaphragma juglandis Fructus)，为带骨质内果皮的种隔，完整呈类圆形或椭圆形，直径约2.5 cm。核桃隔膜中药制品用于肾虚遗精，滑精，遗尿，泻痢［1-3］。国内外对核桃属植物［4-7］药用性研究较多，从核桃仁、青皮、壳枝叶等部位发现抗肿瘤、抗氧化活性成分。新疆医科大学对新疆地区核桃品种内隔膜研究发现［8］，多糖是核桃隔膜主要有效成分之一。目前对于核桃内隔膜粗多糖未有系统的测定方法，造成资源浪费。

超声波提取法利用超声波的空化效应［9，10］，保持体系稳定温度，使植物活性成分在不被破坏的情况下溶出。响应面分析方法［11，12］(response surface methodology，RSM)可用于确定各种因素及其交互作用在工艺过程中对指标(响应值)的影响，精确的表述因素和响应值之间的关系。本实验主要以三峡库区城口乌皮香核桃品种为原料，探索其隔膜粗多糖的提取工艺并进行抗氧化测定，以期对核桃的综合利用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

核桃隔膜，选自重庆城口乌皮香品种，经重庆三峡学院生物与食品基础实验教学示范中心主任周浓副教授鉴定为胡桃科核桃属乌皮香核桃的果核內木质隔膜;粉碎机将其打成粉末，过40 目筛;葡萄糖标准品(色谱纯)，上海楚定分析仪器有限公司;其他试剂为常规试剂。

1.2 仪器与设备

JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司;FZ102 微型植物粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司;ZXFD-A5250 型电热恒温培养箱，上海恒科学仪器有限公司;AL104 电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;5417R 冷冻离心机，德国eppendorf 公司;HH-4 数显恒温水浴锅，江苏金坛市荣华仪器制造有限公司;RE-52 型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂;SHZ-95B 型循环水式多用真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司;UV-2450型紫外可见分光光度计，日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖标准曲线

准确称取105 ℃烘干至恒重的葡萄糖50 mg 于500 mL 容量瓶中配成0.1 mg/mL 的标准溶液，分别精密吸取标准对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 置于带塞试管中，然后依次精密加入2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0 mL 蒸馏水，在标准液中分别加入5%苯酚溶液1 mL，并迅速加入浓硫酸5 mL，静置10 min。摇匀，30 ℃条件下放置30 min 后于490 nm 测定吸光值，以葡萄糖含量为横坐标，吸光值为纵坐标，制作标准曲线。

1.3.2 隔膜粗多糖提取

称取核桃隔膜2.0 g，适当粉碎，室温浸泡过夜，加去离子水40 mL，然后滤取提取液，离心提取液(8000 rpm，15 min)，上清液即为隔膜多糖粗提液。在多糖粗提液中加入3 倍90%乙醇沉淀隔膜多糖，然后将所得的沉淀重新用蒸馏水溶解、定容、备用。吸取1.0 mL 样品溶液，按照上述步骤测出在490 nm 处的吸收值，并代入标准曲线中算出样品的多糖含量，平行测定3 次。

1.3.3 单因素试验

在料液比为1∶40(m∶V)，超声功率105 W，超声温度60 ℃下研究超声波处理时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0 min 对隔膜多糖提取率的影响;在料液比为1∶40(m∶V)，超声功率105 W，超声提取时间为30 min 下研究超声波处理功率分别为100、200、300、400 W 对隔膜多糖提取率的影响;在超声温度60 ℃，超声功率105 W，超声提取时间为30 min 下研究超声波处理料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40(m∶V)对隔膜多糖提取率的影响。

1.3.4 响应面方法的确定

在单因素试验的基础上分别以提取功率、提取时间及料液比3 个因素为考察对象(表1)，以粗多糖提取率为响应值，利用SAS9.2 统计软件分析进行提取条件的优化。

表1 分心木粗多糖提取响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of central composite test on extraction of crude polysaccharide

1.3.5 隔膜对DPPH 自由基清除作用

准确量取3.9 mL 25.61 mg/L 的DPPH 溶液，加入0.1 mL 体积分数70%的乙醇溶液，混匀，在517 nm 波长处测吸光度(Ac)。将各待测样品用相应的提取溶剂配成10、20、40、80、160 μg/mL 分别准确量取0.1 mL 不同浓度的各样品溶液，加入3.9 mL DPPH 溶液(25.61 mg/L)，混合均匀，室温避光反应30 min 后于517 nm 处测定吸光度(Ai)。同时测定3.9 mL 体积分数70%乙醇溶液中加入0.1 mL不同浓度样品溶液的吸光度(Aj)［13］，以BHT 作为阳性对照。DPPH 清除率按以下公式计算:

式中:Ai为样品DPPH 溶液的吸光度;Aj为样品乙醇溶液的吸光度;AC为空白对照的吸光度。

1.3.6 隔膜对ABTS+自由基清除作用

取5 mL 7 mmol/L 的ABTS+溶液，加入88.0 μL 140 mmol/L 的过硫酸钾在室温下置于暗处反应12～16 h 形成ABTS+自由基储备液。在734 nm处，用体积分数70%的乙醇将ABTS+自由基储备液稀释至吸光度为0.70 ±0.02 备用。准确量取0.1 mL 浓度10、20、40、80、160 μg/mL 的样品溶液，加入3.9 mL ABTS+溶液，混匀，在室温下反应6 min后734 nm 出测定吸光度AE［14-16］。同时吸取3.9 mL ABTS+溶液，加入0.1 mL 体积分数70%的乙醇溶液于734 nm 处测定吸光度AB。ABTS+自由基清除率计算公式如下:

式中:AB为样品ABTS+溶液的吸光度;AE为空白对照的吸光度。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的测定

将配制好的不同浓度葡萄糖标准品对照溶液在490 nm 波长处测定吸光度A，得到回归方程Y=12.92X+0.013，R=0.9998。表明葡萄糖浓度在0.0050～0.0135 mg/mL 范围内线性良好。

2.2 回收率实验

将一定量的葡萄糖标准品放入已知多糖含量的隔膜中，由表2 可见，回收率实验符合定量分析要求。

表2 葡萄糖含量回收率实验Table 2 Recovery experimental results

2.3 隔膜粗多糖提取的单因素实验

图1 不同提取时间(A)、功率(B)及料液比(C)对提取率的影响Fig.1 Effects of extraction time (A)，extraction power (B)and solid-to-liquid ratio (C)on the extraction rate of polysaccharide

图1 为不同提取功率、提取时间及料液比下隔膜粗多糖的提取率。总的来说，提高超声波功率会得到较高提取率。但功率超过300 W 时，高强度会破坏粗多糖结构，影响提取率。当提取时间超过1.5 min，粗多糖溶解度达到饱和状态，粗多糖提取率反而逐渐下降。随着超声时间延长，植物细胞被破坏，内溶物流出影响粗多糖提取率，故提取时间为1.5 min。超声功率300 W，提取时间1.5 min 的条件下，料液比从1 ∶10 提高到1 ∶20 时，提取率从2.73%增加到3.25%，进一步提高料液比，提取率下降。

2.4 响应面实验

根据Box-Benhnken 的中心组合试验设计原理，在单因素试验基础上，确定中心组后试验的因素和方法，以粗多糖得率为响应值。超声波辅助提取隔膜粗多糖的响应面试验的3 因素5 水平进行优化试验设计与结果(表3)对试验数据进行回归分析，回归模型的方程为:

表3 隔膜粗多糖提取响应面试验设计方案及结果Table 3 Experimental design and result of central composite test on extraction of polysaccharide

对该响应面回归模型进行方差分析(表4)。从此模型的方差分析表可知，响应面回归模型达到显著水平(P=0.0352＜0.05)，复相关系数R2为0.7158，说明该二次模型能够拟合真实的试验结果，试验误差小。

表4 回归方程的方差分析表Table 4 Analysis of variance of the regression model

从二次多项式回归模型系数的显著性检验结果(表5)可知，在所选的各因素水平范围内，对乌皮香核桃隔膜粗多糖提取影响因素大小顺序为:提取时间＞提取功率＞料液比。由显著性检验可知X2、X1X3对核桃隔膜粗多糖提取率极显著(P＜0.01)，X1、X3、X1X2、X2X2、X2X3的影响显著(P＜0.05)，X1X1、X3X3不显著。

根据回归方程做出响应面图(图2)。图2 可直观反映各因素对响应值的影响。超声功率、时间及料液比的交互作用对隔膜粗多糖提取均有一定影响，其中以X1 和X3 之间的交互影响明显，表现为曲面较陡。X1 和X2、X2 和X3 交互影响不显著。

表5 二次多项式回归模型系数的显著性检验结果Table 5 Regression coefficients of predicted quadratic polynomial model

图2 因素交互作用对隔膜粗多糖提取率影响的响应曲面和等高线Fig.2 Response surface plots and contour plots showing the interactive effects of different factors on the extraction yield of polysaccharide

由SAS 分析得到响应值Y 最大估计值为26.94 mg/g，此 时X1、X2、X3对应的编码值分别为0.076778、-0.053771、-0.380417，实际值为超声功率:312.9 W，提取时间为1.45 min，料液比为1∶23.61。为了实际操作方便选择超声功率310 W，提取时间为87 s，料液比为1∶24 g/mL 对核桃隔膜粗多糖提取进行验证试验。3 次平行试验得到的实际皂苷提取率为24.88 mg/g，与预测值非常接近，相对误差7.65%。因此利用响应面发优化隔膜粗多糖提取条件是可行的。

2.5 乌皮核桃隔膜粗多糖抗氧化性分析

乌皮香核桃隔膜粗多糖的抗氧化活性实验结果如表6 所示。从表6 可以看出，以BHT 为阳性对照［17］，隔膜皂苷对DPPH 自由基和ABTS+自由基均有清除能力［18］，并随着质量浓度的增加而加强，呈一定线性关系，R2分别为0.9325 和0.9655，其EC50分别为1.19 mg/mL 和1.21 mg/mL。

表6 乌皮香核桃隔膜粗多糖清除DPPH、ABTS +自由基能力Table 6 Antioxidant effect and scavenging capacity against DPPH and ABTS + of Wu walnut polysaccharide

3 结论

核桃隔膜为民间用药，许多地区用隔膜代茶饮用有固肾涩精的疗效，但其药用价值没有得到足够的重视。研究发现，隔膜含多种活性成分［19，20］，但目前没有系统的提取方法和药理活性鉴定。根据Box-Benhnken 的中心组合试验设计原理，在单因素试验的基础上采用了3 因素5 水平的响应面分析方法对乌皮香核桃隔膜粗多糖的提取工艺进行了优化。结果显示隔膜粗多糖提取的最佳提取工艺条件为∶超声功率310 W，提取时间为87 s，料液比为1∶24 g/mL。在此条件下测得实际提取率为24.88 mg/g 与预测值的相对误差为7.65%。同时得到了隔膜粗多糖提取率与各因素变量的二次多项式回归方程，该模型回归显著，实验拟合较好，具有实际应用价值。抗氧化活性实验表明隔膜粗多糖对自由基清除效果明显，有较强的抗氧化活性。本研究对开发库区资源乌皮香核桃农副产品加工利用提供一定的研究基础。

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