排风藤内生真菌PFT-2 发酵产物抗氧化活性研究

杨 扬，苏香萍*，李则君，汪鋆植，2，邹 坤，2

1三峡大学生物与制药学院;2 三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室，宜昌 443002

植物内生菌(entophytic fungal)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物各种组织和器官内部或细胞间隙的真菌或细菌［1］。许多研究［2-4］表明，植物内生菌能产生多种全新的活性物质，作为生物防治资源、外源基因的载体和新药的来源，在农业、医药、食品卫生领域有着巨大的应用潜力。

排风藤(Solanum cathayanum)为茄科植物千年不烂心的干燥全草，为植物白英的全草［5］。夏秋采收，晒干，生用，亦用鲜品。生长于海拔200～1400 m 处山坡阴湿处及灌木丛中，主产于三峡地区的巴东、长阳、秭归、兴山以及神农架，全国大部分地区均有分布［6］。排风藤其性微寒，味苦，具有清热利湿、解毒消肿之功效，且富含生物碱、黄酮、萜类和甾体等化合物［7］，具有抗炎、保肝护肝和抗氧化活性［8，9］。

文献［10］从排风藤中分离得到18 株菌株，其中两株菌株的代谢产物的抗菌活性较强。目前国内外对排风藤的研究主要集中在排风藤药材提取物的成分和活性［8，9］，而未见排风藤内生真菌代谢产物生物活性的研究报道。本文对排风藤内生真菌PFT-2进行发酵扩大培养，并对各提取物做抗氧化活性的研究，为排风藤内生真菌的这一微生物资源的研究开发提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 出发菌株

排风藤内生真菌PFT-2 (Rhizoctonia.sp.PFT02)，本实验室提供并培养。

1.2 实验试剂

二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)，Sigma 公司;石油醚、氯仿、正丁醇、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、Vc、无水乙醇、铁氰化钾、三氯化铁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三氯乙酸均为国产分析纯试剂。

1.3 实验仪器

UV-3100 型紫外可见分光光度计，上海美普达仪器有限公司;立式压力蒸汽灭菌锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂;GSP-9270MBE 隔水式恒温培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂;EYELA旋转蒸发仪旋转蒸发器;超净工作台，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

2 实验方法

2.1 培养基

PDA 液体发酵培养基的制备:称取2000 g 马铃薯，洗净去皮切碎，加水煮沸0.5 h，纱布过滤，定容至10 L，再加蔗糖200 g，充分溶解，分装于三角瓶，200 mL/500 mL 瓶，121 ℃，灭菌30 min。

2.2 种子液制备

将本实验室分离保藏的菌株排风藤PFT-2 菌株接种到PDA 斜面培养基中活化，28 ℃恒温培养箱培养7 d，观察菌株生长状态，是否和母斜面相同。将活化好的PFT-2 菌株接种到PDA 液体发酵培养基中，28 ℃恒温摇床培养3 d 左右，记录观察发酵液特征，如正常可接入发酵培养基扩大培养。

2.3 发酵培养

将上述种子液按照5%的接种量接种到8 L 的PDA 液体发酵培养基中，即40 瓶200 mL/500 mL装的锥形瓶，28 ℃恒温摇床培养14 d，观察发酵液状态，菌丝体形态大小、颜色及密度不再变化为准。

2.4 代谢产物分离提取和样品制备

发酵液萃取:将发酵液用4 层纱布过滤，发酵滤液用等体积的乙酸乙酯萃取，萃取发酵液三次，直至颜色为无色。合并萃取液，置于圆底烧瓶中，旋转蒸发去除溶剂，得发酵液乙酸乙酯萃取物。

菌丝体提取:发酵液过滤后菌丝体，先60 ℃烘干，再研磨成粉，称取各菌株菌丝100 mL，用800 mL甲醇超声萃取3 次，每次30 min 冷浸抽提，合并提取物旋蒸浓缩得到菌丝体甲醇总提物。取适量菌丝体甲醇总提物用蒸馏水混悬后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇，丙酮、甲醇提取得到菌丝体甲醇总提物各部位，即石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、丙酮提取物、甲醇提取物、水层剩余物和水不溶物，将所有提取物冷藏于冰箱中，备抗氧化活性测定之用。

2.5 抗氧化活性测定

2.5.1 DPPH·清除能力［11，12］

向试管中依次加入1.0 mL 0.15 mmol/L DPPH·溶液和1.0 mL 甲醇，总体积为2.0 mL，混匀20 min后，测定吸光度(A 为517 nm)，记为A0;加入1.0 mLDPPH·溶液和1.0 mL 待测试样溶液，测定值记为Ai;加入1.0 mL 甲醇和1.0 mL 待测试样溶液，测定值记为Aj，按下式计算DPPH·清除率。

样品清除DPPH·能力采用IC50值表示。并以维生素C(Vc)作抗氧化活性对照实验。

2.5.2 Fe3+还原力的测定［13］

准确称取样品100 mg，溶剂溶解并定容至10 mL，配制成质量浓度为10 mg/mL 样品溶液，稀释成不同质量浓度，取2.5 mL 各浓度的样品溶液，加入2.5 mL 0.2 mol/L 磷酸缓冲液及2.5 mL 1%铁氰化钾，50 ℃水浴反应20 min 后，急速冷却，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液混匀，0.2 μm 水相滤膜过滤，取上清液5 mL，加入5 mL 0.02%三氯化铁溶液混匀，10 min 后于700 nm 波长处测定吸光度A。吸光度越大则还原能力越大，以VC作为阳性对照。

3 结果与讨论

3.1 发酵液的培养状态

PFT-2 内生真菌接种发酵培养到第5 d 时，菌丝球的颜色由乳白色逐渐变为黄色，其大小均匀，发酵液无色澄清;PFT-2 内生真菌发酵培养到第12 d 时，菌丝球变为墨绿色，并且大部分菌丝球变得松散呈絮状，发酵液仍为澄清无色，此状态持续到第14 d发酵结束。

3.2 发酵液乙酸乙酯萃取物和菌丝体甲醇总提物抗氧化活性结果

DPPH·是一类较为稳定的芳香类自由基，天然抗氧化物质对DPPH·的清除能力被认为是抗氧化物质清除自由基的总能力，因此DPPH·法被广泛用于各种物质体外抗氧化活性的研究中。另外Fe3+还原能力的测定，可检验提取物是否为良好的电子供应体，提取物通过提供电子使Fe3+还原为Fe2+，根据体系吸光度的大小可以反应出提取物的还原力强弱，吸光度越大，还原力越强，说明其抗氧化活性就越强。

表1 各样品对DPPH·的清除率Table 1 Scavenging rates of samples against DPPH· %

由表1 可知，乙酸乙酯萃取PFT-2 内生真菌的滤液，甲醇浸泡粗提的PFT-2 内生真菌的菌丝体，两个样品都对DPPH·均有一定的清除活性，并且在一定质量浓度范围内，清除DPPH·的能力均随着样品物质量浓度的增大而增强，而在实验的质量浓度范围内，菌丝体甲醇总提物在各质量浓度条件下清除DPPH·的能力明显强于发酵液乙酸乙酯萃取物，则选择菌丝体甲醇总提物做进一步的抗氧化活性研究。

3.3 菌丝体甲醇总提物的不同极性部位的抗氧化活性

由图1 可知，在一定质量浓度范围内，菌丝体甲醇总提物的各极性部位对DPPH·的清除作用呈随浓度增大而增加趋势，但当达到一定浓度后样品对DPPH·的清除率随浓度增大，变化趋于平缓，同时各种提取物对DPPH·的清除效果与提取剂的极性也有一定关系，清除效果较好的物质主要集中在甲醇、正丁醇、丙酮等极性较大的溶剂中。在实验的质量浓度范围内，不同有机溶剂的萃取物在各质量浓度条件下清除DPPH·的能力为:VC＞菌丝体甲醇提取物＞菌丝体正丁醇部位＞菌丝体甲醇总提物＞菌丝体乙酸乙酯部位＞菌丝体丙酮提取物＞水层剩余物＞菌丝体氯仿部位＞菌丝体石油醚部位，故PFT-2 内生真菌次级代谢产物中抗氧化活性成分主要分布在甲醇提取物，当质量浓度达到5.000 mg/mL 时，其清除率达到83.3%。活性最差的在石油醚部位，当质量浓度达到5.000 mg/mL 时，其清除率仅为38.1%。

图1 菌丝体甲醇总提物的不同极性部位对DPPH·的清除率Fig.1 DPPH· scavenging rates of different polar fractions of the total methanol extract from mycelium

3.4 菌丝体甲醇总提物各部位样品对DPPH·清除活性IC50值的影响

由表2 可见，萃取物或提取物对DPPH·清除活性IC50值顺序为:甲醇提取物＜VC＜丙酮提取物＜正丁醇部位＜甲醇总提物＜乙酸乙酯部位＜水层剩余物＜氯仿部位＜石油醚部位。IC50越小说明对DPPH·的清除效果越好，在各种提取物中，甲醇提取物的活性最强。IC50值最大的为石油醚提取物4.510 mg/mL。

表2 菌丝体甲醇总提物的不同极性部位对DPPH·清除活性的IC50值Table 2 IC50values of different polar fractions of the total methanol extract from mycelium in DPPH· assay

图2 菌丝体甲醇总提物的不同极性部位对Fe3+还原力曲线Fig.2 Fe3+ reducing power curves of different polar fractions of the total methanol extract from mycelium

3.5 菌丝体甲醇总提物的不同极性部位对Fe3+还原力测定

由图2 可看出，PFT-2 内生真菌次级代谢产物的提取物对Fe3+具有较强的还原能力，其还原能力强弱为:甲醇提取物＞丙酮提取物＞正丁醇部位＞甲醇总提物＞VC＞乙酸乙酯部位＞水层剩余物＞氯仿部位＞石油醚部位。其中乙酸乙酯部位、水层剩余物、氯仿部位表现出与VC相当的还原能力，甲醇部位、丙酮提取物、正丁醇部位、甲醇总提物明显强于VC;石油醚部位还原能力弱于VC。

4 结论

在DPPH·的清除实验中，从清除率及IC50来看，排风藤PFT-2 内生真菌的次级代谢产物中抗氧化物质应该主要是一些强极性物质，这些物质容易被甲醇、正丁醇、丙酮等极性溶剂提取获得，而氯仿、石油醚等溶剂提取所得的弱极性物质活性很低或者不具活性。

在Fe3+还原力的测定实验中，排风藤PFT-2 内生真菌的次级代谢产物的提取物的还原力强弱顺序为:甲醇提取物＞丙酮提取物＞正丁醇部位＞甲醇总提物＞VC＞乙酸乙酯部位＞水层剩余物＞氯仿部位＞石油醚部位，与DPPH·的清除实验所得结果基本一致。

DPPH·法和Fe3+还原力测定结果表明，排风藤PFT-2 内生真菌的次级代谢产物具有较强的清除DPPH·能力。排风藤PFT-2 内生真菌可大规模固体培养，且培养基价格低廉，培养条件容易控制，其次生代谢产物有望开发为天然抗氧化剂，并有可能开发为活性抗氧化单体的天然来源。

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