盐生肉苁蓉总苷对实验性肝损伤的保护作用

王艳芳，赵继军，海鹏丽，薛培凤，李 辉，李旻辉*

1包头医学院，包头 014040;2 包头医学院第一附属医院，包头 014010;3 内蒙古医科大学药学院，呼和浩特 010110;4 内蒙古大芸生物有限公司，包头 014010

盐生肉苁蓉(Citanche salsa)是列当科(Orobanchaceae)肉苁蓉属(Cistanche)植物，又名盐生大芸，为多年生草本寄生植物，主要分布于荒漠、沙漠等干燥地带，主要产区在我国新疆和内蒙古［1］。由于其同科同属药材肉苁蓉(Herba Cistanche)被大量采挖，加之寄生植物繁殖困难，药用资源日趋减少，难以满足市场需求。在我国民间盐生肉苁蓉被用于肉苁蓉的代用品，但其研究报道较少。为进一步明确其药用价值，对盐生肉苁蓉总苷(total glycosides of Cistanche salsa)，一类含苯乙醇苷类结构成分的物质进行了药理研究。盐生肉苁蓉总苷对神经具有保护作用［2］，并能保护羟基(OH·)引发的DNA 氧化损伤［3］。盐生肉苁蓉苯乙醇苷可以显著提高小鼠心、肝、脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性［4］。以上研究提示盐生肉苁蓉总苷具有抗氧化的作用。

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)的发病率在我国呈逐年上升的趋势，酒精已成为继病毒性肝炎后导致肝损害的第二大病因［5］。对于酒精性肝损伤的治疗，现缺少安全有效的药物。如何利用植物资源开发解酒保肝的药物及保健品受到医药及食品行业的广泛关注，经大量查阅文献发现酒精性肝损伤和氧化应激有关系，而盐生肉苁蓉总苷对酒精性肝损伤的保护作用研究尚属空白，本实验的研究为盐生肉苁蓉总苷开发、利用提供科学依据。

1 材料与仪器

1.1 药品与试剂

盐生肉苁蓉由包头医学院蒙药材鉴定与标准化重点实验室提供;联苯双酯滴丸(浙江万邦药业股份有限公司，批号A02121139);丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒、丙二醛(MDA)测试盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20110422);56°白酒(北京红星股份有限公司);其他试剂为国产分析纯。

1.2 动物

昆明种雄性小鼠72 只，体重17～22 g(内蒙古大学实验动物中心，动物合格证号:scxk(蒙2002-0001))。

1.3 仪器

紫外可见分光光度计［尤尼柯(上海)仪器有限公司，型号UV-2000］;酶标仪(美国贝克曼库尔特，型号AD340);高速离心机(杭州艾普仪器设备有限公司，型号TG18-WS);高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技，型号Ultimate 3000);分析天平(梅特勒—托利多仪器有限公司，型号AR153O);超声振荡仪(上海Branson，型号SB3200);冷冻干燥剂(北京博医康实验仪器有限公司，型号FD-1-50)。

2 方法与结果

2.1 盐生肉苁蓉总苷活性研究

2.1.1 盐生肉苁蓉总苷提取

2.1.1.1 粗提物的提取

称取盐生肉苁蓉粗粉100 g，加70%乙醇600 mL 浸泡3 h，超声提取30 min，过滤，滤渣重复上述步骤2 次，合并滤液浓缩回收乙醇至无醇味，收集提取物冷冻干燥，得盐生肉苁蓉粗提浸膏19.46 g。

2.1.1.2 纯化过程

将盐生肉苁蓉粗提浸膏10 g 置于烧杯中，加20 mL 水在超声波中溶解，加80 mL 无水乙醇摇匀静止放置12 h，过滤，滤液浓缩回收乙醇至无醇味，冷冻干燥，得盐生肉苁蓉总苷提取物8.408 g。

2.1.2 动物的分组与给药

72 只小鼠，实验前适应性喂养2 d，随机分为6组，每组12 只，分别为空白对照组、酒精性肝损伤模型组、阳性对照组(150 mg/kg 联苯双酯)、盐生肉苁蓉总苷高剂量组(130 mg/kg)、盐生肉苁蓉总苷中剂量组(100 mg/kg)和盐生肉苁蓉总苷低剂量组(65 mg/kg)。各组动物每日灌胃(ig)给药2 次，ig容积均为0.2 mL/20 g 体重。空白对照组和模型组给予等体积的生理盐水。每次给药后2 h，除空白对照组外，其余各组按0.4 mL/20 g 体重ig 给予56°白酒，连续10 d 造成急性酒精性肝损伤模型。于造模第9 d 禁食不禁水，第10 d 给予56°白酒3 h 后眼球取血并分离血清，取血后处死小鼠，迅速摘取肝脏，冰冷的生理盐水漂洗，滤纸吸干后称重，取肝脏右叶置于10%甲醛固定液中，其余肝脏置于-20 ℃的冰箱中。

2.1.3 统计学处理

应用SPSS 11.5 统计软件处理数据，方差分析，P＜0.05 有统计学意义。

2.1.4 盐生肉苁蓉总苷对小鼠急性酒精性肝损伤的体重、肝重和肝脏指数的影响

如表1 所示，模型组小鼠的肝重和肝脏指数与空白对照组相比显著升高(P＜0.05)，表明肝脏受损。与模型组相比，盐生肉苁蓉总苷高剂量组与阳性对照组小鼠的肝重和肝脏指数显著降低(P＜0.01)，盐生肉苁蓉总苷中、低剂量组无显著差异(P＞0.05)。

表1 盐生肉苁蓉总苷对小鼠的体重、肝重影响(¯，n=9)Table 1 The effect of total glycosides of C.salsa on body weight and liver weight (¯，n=9)

表1 盐生肉苁蓉总苷对小鼠的体重、肝重影响(¯，n=9)Table 1 The effect of total glycosides of C.salsa on body weight and liver weight (¯，n=9)

注:与空白对照组比较，△P＜0.05;与模型组比较，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01Note:Compared with blank control，△P＜0.05;compared with model group，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01

2.1.5 盐生肉苁蓉总苷对血清AST 和ALT 的影响

如表2 所示，模型组小鼠血清中ALT、AST 与空白对照组相比显著升高(P＜0.05)，说明模型组造模成功。阳性对照组小鼠血清ALT、AST 与模型组相比均显著降低(P＜0.01)。盐生肉苁蓉总苷高剂量组小鼠血清ALT、AST 与模型组相比显著降低(P＜0.01)。盐生肉苁蓉总苷中、低剂量组与模型组比较均无显著性差异(P ＞0.05)。

表2 盐生肉苁蓉总苷对血清中ALT、AST 的影响(¯，n=9)Table 2 Effects of total glycosides of C.salsa on serum aminotransferase activities (¯，n=9)

表2 盐生肉苁蓉总苷对血清中ALT、AST 的影响(¯，n=9)Table 2 Effects of total glycosides of C.salsa on serum aminotransferase activities (¯，n=9)

注:与空白对照组比较，△P＜0.05;与模型组比较，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01。Note:Compared with blank control，△P＜0.05;compared with model group，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01.

2.1.6 盐生肉苁蓉总苷对肝脏中的MDA 含量和SOD 活性的影响

取0.3 g 肝脏组织制备10%和1%匀浆液，将1%肝脏匀浆与3.5 ×103r/min 离心10 min 取上清液，采用考马斯亮蓝法测定肝匀浆中的蛋白。取1%肝脏匀浆上清液，按SOD 测试盒操作，酶标仪450 nm 处读数。取10%肝脏匀浆上清液，按MDA测定试剂盒操作，分光光度计532 nm 测吸光度(A532)。

如表3 所示，模型组小鼠肝脏中的MDA 含量与空白对照组相比显著升高(P＜0.05)，SOD 活性显著降低(P＜0.05)。阳性对照组小鼠肝脏中的MDA 含量与模型组相比显著降低(P＜0.01)，SOD的活性显著增高(P＜0.01)。盐生肉苁蓉总苷高剂量组MDA 含量与模型组相比显著降低(P＜0.01)，SOD 的活性显著增高(P＜0.01)。盐生肉苁蓉总苷中、低剂量组MDA、SOD 与模型组相比均无差异(P＞0.05)。

表3 盐生肉苁蓉总苷对肝脏组织中MDA、SOD 含量的影响(¯，n=9)Table 3 Effects of total glycosides of C.salsa on hepatic MDA，SOD levels (¯，n=9)

表3 盐生肉苁蓉总苷对肝脏组织中MDA、SOD 含量的影响(¯，n=9)Table 3 Effects of total glycosides of C.salsa on hepatic MDA，SOD levels (¯，n=9)

注:与空白对照组比较，△P＜0.05;与模型组比较，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01。Note:Compared with blank control，△P＜0.05;compared with model group，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01.

2.1.7 盐生肉苁蓉总苷对小鼠肝组织病理变化的影响

病理学检查:10%甲醛固定的肝组织，常规石蜡包埋切片(片厚5 μm)，HE 染色，光镜下观察肝组织病理学变化。

空白对照组小鼠肝脏色泽暗红色，质地软，镜下见肝组织结构正常，肝小叶结构完整，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝索呈网状排列，肝血窦明显，细胞呈多边形，分界清楚，细胞核圆而清晰位于细胞中央。模型组和盐生肉苁蓉总苷中、低剂量组小鼠肝脏体积增大，颜色发黄，镜下病理变化以肝细胞脂肪变性为主，可见细胞内弥漫性的脂质空泡，肝细胞肿大，胞浆内充满了微小脂滴空泡，核仍在中央。阳性对照组和盐生肉苁蓉总苷高剂量组小鼠肝细胞脂变情况有一定程度的减轻，脂滴数量有一定程度的降低。

油墩子是将调稀的面糊，少许倒入椭圆形铁勺中，加葱花和咸的萝卜丝，最后用箸挟上一条溪虾，再复以面糊入油锅炸，出锅的油墩子搁在油锅上端的铁丝网里“嘀溜溜”地沥着残油，香味早已让百米之内的人折服。演变后的油墩子省去了虾的原料，馅料就是清香的萝卜丝。

图1 空白对照组(A)、模型组(B)、阳性对照组(C)、肉苁蓉总苷高剂量组(D)、肉苁蓉总苷中剂量组(E)、肉苁蓉总苷低剂量组(F)的小鼠肝脏病理变化(HE×400)Fig.1 Histological changes in mice liver of blank control group (A)，model group(B)，positive control group(C)，C.salsa total glycosides high dose group(D)，C.salsa total glycosides middle dose group (E)and C.salsa total glycosides low dose group (F)［All sections were stained with hematoxylin and eosin(×400)］

2.2 盐生肉苁蓉总苷主成分分析

2.2.1 色谱条件

色谱条件为色谱柱ZORBAX ODS(250×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇-0.2%甲酸溶液(27.5∶72.5)，梯度洗脱;柱温30 ℃;流速1 mL/min;检测波长334 nm。以上色谱条件时，松果菊苷与毛蕊花糖苷分离度良好，见图2。

图2 对照品(A)、样品(B)的高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of reference standards (A)and sample (B)

2.2.2 对照品溶液制备

精密称取松果菊苷、毛蕊花糖苷对照品1.3 mg、1.2 mg，制成0.13 mg/mL 松果菊苷对照品溶液和0.12 mg/mL 毛蕊花糖苷对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液制备

精密称取0.1082 g 盐生肉苁蓉总苷提取物，用流动相溶液定容至50 mL。

2.2.4 线性关系

精密吸取对照品溶液0.06、0.12、0.18、0.24、0.30、0.48、0.54、0.72、1.20 mg/mL，依次进样5 μL入液相色谱仪，以2 种对照品的进样量(μg)为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，计算回归方程。松果菊苷:Y=11.868X-0.0785，R=0.9997;毛蕊花糖苷:Y=18.026X-0.1913，R=0.9997，结果松果菊苷对照品在0.0635～0.4445 μg 范围内线性关系良好;毛蕊花糖苷对照品在0.059～1.18 μg 范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液10 μL，在上述色谱条件下依法重复进样5 次，记录色谱图，测定其峰面积，结果松果菊苷的RSD 1.89%，毛蕊花糖苷的RSD 1.87%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验

同一份供试品溶液，分别于0、2、4、8、16、32、40、48 h，精密吸取10 L，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定其峰面积，结果松果菊苷的RSD 1.58%，毛蕊花糖苷的RSD 0.49%，表明供试品溶液在48 h 内稳定性良好。

2.2.7 重复性试验

精密称取同一批样品约0.2 mg，共5 份，制备溶液5 份，按含量测定方法，分别精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定其峰面积，结果松果菊苷的RSD 1.91%，毛蕊花糖苷的RSD 2.08%，表明测定方法具有良好的重复性。

2.2.8 回收率试验

精密称取盐生肉苁蓉总苷0.2 g，分别加入一定量的松果菊苷与毛蕊花糖苷对照品，照上述2.2.3项下方法制得供试品溶液，在规定色谱条件下，按含量测定方法进行测定，结果松果菊苷的平均回收率为98.49%，RSD 1.06%，毛蕊花糖苷的平均回收率为97.35%，RSD 1.45%。

2.2.9 样品的测定

精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，进样，照上述色谱条件测定，以外标法计算样品含量，结果见表4，松果菊苷平均含量为24.5%，毛蕊花糖苷平均含量为4.6%。

表4 盐生肉苁蓉总苷中松果菊苷与毛蕊花糖苷的含量测定结果(%)Table 4 Content determination results of echinacoside and acteoside in total glycosides of C.salsa (%)

3 讨论

酒精性肝损伤，是指由于长期大量饮酒而导致的肝脏损害及一系列病变。长期过量酒精摄入，会导致肝细胞损伤，进而发展为肝纤维化，甚至肝硬化［6］。本实验盐生肉苁蓉总苷高剂量组与模型组相比，小鼠血清中ALT、AST 活性显著降低，肝脏中MDA 含量显著降低，SOD 的活性显著增高，一定程度的减轻了肝细胞脂变情况，降低脂滴数量。中、低剂量组与模型组比较均无显著差异。本实验结果与肉苁蓉总苷对小鼠酒精性肝损伤的保护作用研究结果一致［7］。盐生肉苁蓉总苷保护肝细胞损伤，可通过降低应细胞膜通透性增加，释放入血液中的ALT、AST 含量;可升高SOD 的活性，清除因酒精在机体代谢过程中产生的大量自由基;可降低MDA 形成，阻止其损伤组织细胞的膜性结构［8-10］。盐生肉苁蓉总苷对酒精性肝损伤具有保护作用，且存在量-效应关系。查阅文献，未见有盐生肉苁蓉总苷活性成分的定量分析。本文通过HPLC 首次定量分析了盐生肉苁蓉总苷主要成分毛蕊花糖苷和松果菊苷含量，占总苷29.1%。为盐生肉苁蓉总苷的开发、利用提供科学依据。

现代药理学研究发现，松果菊苷对过氧化氢损伤的PC12 细胞及血管性痴呆大鼠氧化应激损伤均有保护作用［11，12］。松果菊苷和毛蕊花糖苷对DGalN 及TNF-α 诱导的肝细胞的细胞毒均有抑制作用［13］。进而推测盐生肉苁蓉总苷保护小鼠酒精性肝损伤可能是通过松果菊苷和毛蕊花糖苷增强细胞抗氧化酶活性，提高了肝细胞的抗氧化能力，从而维持肝细胞质膜的完整性，使肝细胞发挥正常的防御和代偿功能。我们将在以后的研究中进一步分离化合物，运用分子生物学技术，研究单体化合物调节肝细胞凋亡及其与相关靶基因调控的关系。

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