PI3K/Akt/GSK-3β 信号通路在6-姜酚保护PC12 细胞对抗β 淀粉样蛋白诱导细胞凋亡的作用

曾高峰，宗少晖，傅松文，农梦妮，李柯柯，严芳娜

1 广西医科大学公共卫生学院;2 广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科;3广西医科大学研究生学院，南宁 530021

已有的研究表明，阿尔茨海默病发病过程中的神经退行性改变与β 淀粉样蛋白的过量分泌密切相关［1］。体内实验显示，大鼠脑室内注射入Aβ 后，表现出认知功能、记忆功能降低等AD 样症状及神经元细胞凋亡等［2］。因而，抑制Aβ 诱导的神经元变性可能对AD 的防治具有重要作用。此外，大量的研究显示Aβ 引起的神经毒性作用与PI3K/Akt/GSK-3β 信号通路密切相关［3，4］。故逆转Aβ 通过PI3K/Akt/GSK-3β 信号通路导致的细胞毒性，可能成为防治AD 的途径之一。研究显示，6-姜酚可减轻Aβ 诱导的SH-SY5Y 细胞凋亡，因而可能具有神经保护作用［5］。然而，6-姜酚对AD 的防治作用尚未清楚，本研究旨在观察6-姜酚在Aβ1-42导致的PC12 细胞凋亡中的作用及其分子信号通路基础。

1 材料与方法

1.1 试剂

β 淀粉样蛋白(1-42)(武汉明皓生物科技股份有限公司)，6-姜酚(上海抚生实业有限公司)，F12K培养基(武汉博士德)，神经生长因子(NGF，美国Millipore 公司)，马血清(美国Gibco 公司)，胎牛血清(美国Gibco 公司)，噻唑兰(MTT，Amresco 公司)，Akt、p-Akt(Ser473)、GSK-3β 及 p-GSK-3β(Ser9)抗体均购自于美国CST 公司，未分化PC12细胞购自中国科学院上海细胞库。

1.2 PC12 细胞的培养

PC12 细胞接种于含10% 马血清、5% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素的F12K培养基中，并置于37 ℃培养箱中培养，每2～3 d 换液一次。

1.3 MTT 法检测PC12 细胞的存活率

PC12 细胞接种于96 孔板，经NGF 诱导分化5 d 后，分别加入5、10 及20 μM Aβ1-42作用24、48 及72 h，MTT 实验分别检测不同浓度Aβ1-42对PC12 细胞作用24、48 及72 h 的细胞存活率;PC12 细胞中分别加入40、80、120、200 及300 μM 的6-姜酚作用4 h 后，加入10 μM Aβ1-42继续培养48 h，MTT 实验检测细胞存活率，以观察6-姜酚对Aβ1-42所致的PC12 细胞凋亡的影响。具体步骤为，药物作用结束后，每孔加入10 μL 5 mg/mL MTT 并置于37 ℃培养箱中孵育4 h，然后弃去反应后的上清液，加入150 μL DMSO 后置于振荡器上振荡10 min，紫色结晶完全溶解后，酶标仪570 nm 波长测吸光度。

1.4 Western blot 分析

药物作用结束后，离心收集PC12 细胞，以PBS漂洗2 遍后，加入RIPA 裂解液并置于冰上以将细胞充分裂解，离心收集上清液，采用BCA 法定量蛋白浓度。蛋白经变性后，以8% SDS-PAGE 进行电泳，蛋白经电泳分离后，采用湿转法将蛋白转移至硝酸纤维膜上。在室温下，以5% BSA 封闭1 h 后，分别加入GSK-3β、p-GSK-3β(Ser9)、Akt 及p-Akt 抗体并置于4 ℃，缓慢平摇孵育过夜。以TBST 进行漂洗4 遍后，加入辣根过氧化酶标记的二抗并于室温下，缓慢平摇孵育1.5 h，再以TBST 进行漂洗4 遍，在暗房中以ECL 发光显色剂对蛋白进行显色，并采用Image J 软件对蛋白条带进行定量分析。

1.5 统计学方法

2 实验结果

2.1 Aβ1-42对PC12 细胞存活率的影响

由图1 可见，分别以5、10 及20 μM 浓度的Aβ1-42 对分化的PC12 细胞进行处理24、48 h 及72 h，各时间组的细胞存活率，随着Aβ1-42浓度的增加而下降，且10、20 μM 组细胞存活率显著下降(P＜0.05);Aβ1-42处理组细胞存活率随着作用时间延长而下降，与作用24 h 相比，48、72 h 各浓度组细胞存活率均显著降低(P＜0.05)。

图1 Aβ1-42对PC12 细胞存活率的影响Fig.1 The effect of Aβ1-42on PC12 cell viability

2.2 6-姜酚对Aβ1-42致PC12 细胞凋亡的抑制作用

如表1 所示，与对照组相比，10 μM Aβ1-42对PC12 细胞进行作用48 h 后的细胞存活率显著下降，而以80、120 及200 μM 的6-姜酚对PC12 细胞进行预处理4 h 后再加入Aβ1-42(10 μM)继续培养48 h 的细胞存活率则较Aβ1-42处理组显著上升(如表2 所示)。表明6-姜酚在80、120、200 μM 时均能显著减少Aβ1-42引起的细胞凋亡，并且120 μM 的6-姜酚作用最明显;但当浓度达300 μM 时，则可加重细胞凋亡。

表1 6-姜酚对Aβ1-42致PC12 细胞凋亡的抑制作用(±S)Table 1 The inhibitory effect of 6-gingerol on Aβ1-42-induced apoptosis in PC12 cells(±S)

表1 6-姜酚对Aβ1-42致PC12 细胞凋亡的抑制作用(±S)Table 1 The inhibitory effect of 6-gingerol on Aβ1-42-induced apoptosis in PC12 cells(±S)

注:与对照组比较，* P＜0.05，与Aβ1-42处理组比较，▲P＜0.05。Note:Compared with the control group，* P＜0.05;Compared with the Aβ1-42treatment group，▲P＜0.05.

2.3 6-姜酚对Aβ1-42诱导的GSK-3β、Akt 磷酸化水平的影响

为了观察PI3K/Akt/GSK-3β 信号通路在6-姜酚保护PC12 细胞对抗Aβ1-42引起的细胞毒性的作用，以80、120 及200 μM 6-姜酚对PC12 细胞进行预处理4 h 后，再加入Aβ1-42(10 μM)继续培养48 h，采用蛋白免疫印迹法检测PC12 细胞中GSK-3β、p-GSK-3β、Akt 及p-Akt 的表达水平。结果显示(图2、图3):10 μM Aβ1-42处理组中PC12 细胞的GSK-3β磷酸化水平较对照组显著降低，而80 及120 μM 的6-姜酚预处理组中GSK-3β 的磷酸化水平则显著高于Aβ1-42处理组的;以10 μM Aβ1-42对PC12 细胞进行作用48 h 后的Akt 磷酸化水平较对照组显著降低，而以80 及120 μM 的6-姜酚对PC12 细胞进行预处理4 h 后再加入Aβ1-42(10 μM)继续培养48 h 的PC12 细胞的Akt 磷酸化水平则显著高于Aβ1-42处理组的。

图2 6-姜酚对Aβ1-42诱导的GSK-3β 磷酸化水平的影响Fig.2 Effect of 6-gingerol on Aβ1-42-induced activation of GSK-3β

图3 6-姜酚对Aβ1-42诱导的Akt 磷酸化水平的影响Fig.3 Effect of 6-gingerol on Aβ1-42-induced activation of Akt

3 讨论与结论

体内研究表明，Aβ1-42可致大鼠神经发生退行性改变［6］。本研究结果显示，PC12 细胞的存活率随着Aβ1-42浓度的增加及作用时间的延长而下降，且10及20 μM Aβ1-42组在作用24、48 及72 h 后的细胞存活率均较对照组显著下降(P＜0.05);与作用24 h相比，48 h 及72 h 各浓度组细胞存活率均显著降低。因而Aβ1-42可诱导PC12 细胞发生凋亡，导致细胞存活率下降，这与以往的研究结果一致［7，8］。而6-姜酚在80、120、200 μM 时均能显著减少Aβ1-42引起的细胞凋亡，并且在120 μM 时抑制效果最明显;但当浓度达300 μM 时，则可加重细胞凋亡。结果表明，6-姜酚在80～200 μM 的浓度范围内，通过对Aβ1-42所致细胞凋亡的抑制作用，表明6-姜酚对Aβ1-42所致的细胞凋亡具有保护作用，但高浓度的6-姜酚(300 μM)则具有毒性作用［9，10］。

AD 的发生与GSK-3β 密切相关。研究表明，tau蛋白的异常磷酸化通过神经毒性作用介导神经退行性疾病的发生，如AD［11，12］，而GSK-3β 的活化可引起tau 蛋白的磷酸化水平异常增高［13］。此外，GSK-3β 的活化可导致细胞凋亡及酶的失活［14］，而GSK-3β 的磷酸化水平增高可抑制GSK-3β 的活性［15］。本研究发现，PC12 细胞经Aβ1-42作用48 h 后，GSK-3β 的磷酸化水平较正常组显著降低，表明Aβ1-42可激活GSK-3β 的活性。以80 及120 μM 的6-姜酚对PC12 细胞进行预处理4 h 后再加入Aβ1-42(10 μM)继续培养48 h 的PC12 细胞的GSK-3β 磷酸化水平则显著高于Aβ1-42处理组的，这表明6-姜酚可抑制由Aβ1-42激活的GSK-3β 活性。因而，6-姜酚对Aβ1-42诱导细胞凋亡的保护作用可能与其抑制GSK-3β 的活性有关。

通过PI3K 通道，Akt 在Ser473 位点发生磷酸化，介导了Akt 的激活［16］，从而具有神经保护作用［17］。研究表明，抑制PI3K/Akt 通道可显著增加GSK-3β 的活性，导致tau 蛋白过度磷酸化［18］，从而与AD 的发生密切相关。而Akt 的激活，可以抑制GSK-3β 的活性［19］。本研究结果显示，Aβ1-42处理组中PC12 细胞的Akt 磷酸化水平较对照组显著降低，而80 及120 μM 6-姜酚预处理组中Akt 的磷酸化水平则显著高于Aβ1-42处理组的，表明Aβ1-42可抑制PC12 细胞的Akt 活性，而6-姜酚可显著抑制Aβ1-42导致的Akt 活性的下降。因而6-姜酚对Aβ1-42诱导细胞凋亡的保护作用可能与其激活Akt 的活性有关。

总之，本研究表明，6-姜酚可能通过PI3K/Akt/GSK-3β 信号通路保护PC12 细胞对抗Aβ1-42诱导的细胞凋亡。

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