莪术油中吉马酮的分离、纯化及结构鉴定

吴 杰，古金华，冯 钰，陈伟强，叶连宝

广东药学院药科学院，广州 510006

莪术(Curcuma zedoaria)是姜科植物蓬莪术、广西莪术和温郁金的干燥根茎，主要产于广西、云南、贵州和浙江等多个省区，具有行气破血、消积止痛之功效。药理学研究发现，莪术油还具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒等作用［1，2］。莪术挥发油化学成分复杂，多为倍半萜类化合物，目前已经确定的结构有20 多种［3，4］，吉马酮(图1)是莪术油中的主要成分之一［5］，其有较强抗肿瘤、抗菌、抗病毒等活性［6-10］。由于吉马酮熔点低、分离纯化不方便，目前国内尚未见文献报道其分离纯化方法，本实验以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂，采用硅胶色谱柱进行粗分，然后以甲醇-水为流动相，半制备液相制备，较方便的得到高纯度的吉马酮，为吉马酮的进一步研究提供参考。

1 材料与仪器

图1 吉马酮化学结构Fig.1 Chemical structure of germacrone

RV8V-C 旋转蒸发仪(德国IKA 公司)、电热真空干燥箱(天津市华北实验仪器有限公司)、XR6A显微熔点仪(上海精密仪器厂)、Bruker Plus 400 核磁共振波谱仪(瑞士Bruker 公司)、日立高效液相色谱仪(日本日立公司)、岛津LC-8A 半制备液相色谱仪(日本岛津公司)。莪术油、吉马酮标准品(批号:PS14022101)(成都普斯生物有限公司)，硅胶(200～300 目)(青岛化工)、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、无水硫酸钠(均为分析纯，广州化学试剂厂)。

2 方法与结果

2.1 吉马酮的分离

取莪术油约100 g，加少量石油醚混匀，取层析柱(内径15 cm，长180 cm)，加入层析用硅胶(200～300 目，已干燥6 h)4000 g，石油醚(60～90 ℃)装柱，将备用莪术油样品湿法装柱。先用石油醚(60～90 ℃)洗脱，再以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(100∶1)洗脱，吉马酮标准品进行薄层对照，合并洗脱液，浓缩，冷藏保存。

2.2 吉马酮的纯化

通过半制备液相［色谱条件:Kromasil C18色谱柱(250×30 mm，5 μm)，流动相为甲醇-水(90∶10);检测波长为220 nm，柱温30 ℃，流速为9.0 mL/min，进样量0.4 mL］的制备，得到纯化后的目标产物。减压浓缩后得到乳白色甲醇水溶液，石油醚(30～60 ℃)萃取，分离石油醚层，无水硫酸钠干燥，浓缩得吉马酮。

2.3 结构确认

2.3.1 熔点检查

照熔点测定法(2010 年版中国药典一部附录VllC)第一法［11］测定产物的熔点，测得熔点为53～55 ℃。与吉马酮标准品(53～55 ℃)一致。

2.3.2 薄层检查

取产物样品以石油醚溶解，得样品溶液;另取标准品以石油醚溶解，得标准品溶液，吸取相同体积的溶液点于同一薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯(80∶1)为展开剂展开，取出，晾干，在紫外灯(254 nm)下观察所得薄层色谱图Rf值为0.4，且均只有一点显色。

2.3.3 高效液相检查

2.3.3.1 色谱条件与系统适用性试验

Kromasil C18柱(250×4.6 mm，5 μm);以甲醇-水(80∶20)为流动相;检测波长为220 nm;柱温30℃;流速为1.0 mL/min。

2.3.3.2 供试品溶液的制备

精密称取样品1.253 mg 置10mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.3.3 标准品溶液的制备

精密配制相同浓度的标准品溶液，摇匀，备用。

2.3.3.4 测定法

精密吸取供试品和标准品各20 μL 注入液相色谱仪中，测定，按外标法计算，样品纯度为99.0%(图谱如图2)。

图2 纯化前样品(A)、吉马酮半制备样品(B)、纯化后吉马酮样品(C)、吉马酮标准品(D)高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of unpurified sample(A)，semi-purified germacrone(B)，purified germacrone(C)and germacrone standard(D)

2.3.4 核磁共振波谱检查

纯化的吉马酮核磁数据如下:1H NMR(CDCl3):δ 4.96(1H，br，d，J=11.7 Hz，H-1)，4.69(1H，br，d，J=8.6 Hz，H-5)，3.38(1H，br，d，J=10.2 Hz，H-9)，2.90(1H，br，d，H-9)，2.93(1H，br，d，H-6)，2.83(1H，br，d，J=11.4 Hz，H-6)，2.36～2.09(m，2H，CH2)，2.13～2.04(m，2H，CH2)，1.74(3H，s，CH3)，1.72(3H，s，CH3)，1.63(3H，br，s，CH3)，1.43(3H，br，s，CH3);13C NMR(CDCl3):δ 207.9(C-8)，137.2(C-4)，132.7(C-1)，132.7(C-11)，129.5(C-7)，126.7(C-10)，125.4(C-5)，55.9(C-9)，38.1(C-3)，29.2(C-6)，24.1(C-2)，22.3(C-12)，19.9(C-13)，16.7(C-15)，15.6(C-14)。

3 讨论

随着近年来癌症发病率和死亡率的提高，有关中药莪术抗肿瘤的药学研究备受瞩目。莪术油是目前已经上市的一种很好的抗肿瘤药物，而莪术油中的有效成分就成为了目前研究的热门，莪术挥发油化学成分复杂，多为倍半萜类化合物，具有沸点高、高温下易氧化等特点，加热时间过长可能引起分解与转化，影响其抗癌功效，并且同分异构体多，理化性质极为相近，因此，寻找一种高效简便的分离纯化方法成为了莪术油有效成分研究的关键。而吉马酮作为其中得一种重要成分，具有很强的研究价值。

由于挥发油本身易挥发性，在分离纯化的过程中存在不易得到样品的问题，在将制备液相纯化后的溶液进行减压蒸馏的过程中，55 ℃减压蒸馏可将大部分甲醇除去，得到不溶于水的产物溶液，呈现乳白色，继续升温75 ℃，减压蒸馏除去水的过程中，当溶液基本除尽后，产物样品也基本全部损失。本实验通过萃取的方法利用低沸点石油醚对其进行纯化，避免了高温旋蒸对吉马酮的破坏;也最大程度上保证了产物的收率，对所得产物进行检测，未发现其结构发生改变;同时在分离的过程中通过多次实验，考察得到较为精细的流动相系统，避免了多次分离对产物含量的损失，提高了分离纯化的效率，为吉马酮的后续研究提供参考。

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