睾穿精畸形部位对ICSI 受精及胚胎发育的影响

于成和，阿周存，张若鹏，吴 睿，张丽蓉，朱 莉

（大理大学附属医院 生殖医学科，云南 大理 671000）

ICSI 技术（Intracytoplasmic Sperm Injection）即卵泡浆内单精子注射，1992 年Palerml 首次对人卵子进行ICSI 操作，成功得到了首例ICSI 婴儿[1]，1996 广州中山医科大学第一附属医院生殖中心为一对少精症不育夫妇助孕成功生下一女婴，成为我国第一例ICSI 婴儿，为我国ICSI 行业做出突破性的贡献。然而影响ICSI 技术的因素很多：精子因素、卵子因素、技术操作、体外环境等。活精子、死精子、不运动的精子、附睾精子和睾丸精子都可被用于ICSI 操作[2]。

世界卫生组织出版的《 人类精液检验与处理实验室手册》（第五版）[3]规定人类精子畸形（Sperm Malformation Rate，SMR）分类：一、头 部（锥形、梨形、圆形、无顶体、小、无定形、有空泡、顶体区域小），二、颈部和中段的畸形（颈部弯折、不对称、中段和头部连接点粗、细），三、尾部畸形（短尾、成角弯折、卷尾、过多的胞浆残余体、精子头部大小的1/3）。本实验研究睾丸穿刺所获得正常形态、头部畸形、颈部畸形、尾部畸形的精子行ICSI，分析不同畸形部位对受精、胚胎发育的影响。

资料与方法 2012 年1 月－2014 年12 月，在大理大学附属医院生殖医学科经患者签署《 大理大学附属医院生殖医学科未成熟配子、废弃卵子、废弃胚胎的处理意向书》并选择用于科学研究的未成熟卵子，经体外培养成熟，玻璃管化冷冻累计达213 枚，玻璃管化解冻后存活194 枚。精子来源于我科室并签署上述协议所废弃的梗阻性无精患者（染色体分析正常）睾丸穿刺所获得精子。

实验分组：实验分为四组，形态正常组、头部畸形组、颈部畸形组、尾部畸形组，分别对应注射正常形态、头部畸形、颈部畸形、尾部畸形睾丸穿刺精子。将上述复苏得194 枚卵子随机分为4 组，每组数目分别为48 枚、49 枚、49 枚、48 枚，并标记为形态正常组、头部畸形组、颈部畸形组、尾部畸形组。

ICSI 注射：上针，配注射盘 先上Holding 针，再上注射针，调节Holding 针和注射针的平面。根据卵子多少，用M-HTF 液制成若干小圆形液滴，中央加入PVP，右边缘用M-HTF 液制成长条形液滴，迅速覆盖油，使液面全部覆盖。并将卵子吸入小圆形液滴内，精子吸入长条形液滴内。

ICSI 操作：将单个活动的精子吸入PVP 中，在精子尾部1/3 处制动，精子吸入显微注射针内，转动卵子使得纺锤体区处于6 或12 点钟位置，其3 点钟位置用Holding 针将卵子固定，将精子推至注射针尖口，将针从卵子的9 点钟方向插入卵子，抽吸胞浆至观察到胞质流动突然加剧，停止抽吸并以正压将精子头注入卵胞浆内再以轻微的负压小心抽出显微注射针，随后Holding 针释放卵子。每组注射结束后，转移至与之相对应标记的生长皿中，放入5%CO2培养箱中培养。

受精与胚胎观察：授精后16～18h 观察并记录受精（记为D1），43～45h 观察并记录胚胎分裂（记为D2），67～69h 观察并记录胚胎发育（记为D3），114～164h 根据囊胚形成情况观察并记录囊胚形成（记为D5-D7）。

统计分析：应用SPSS17.0 统计软件进行数据分析，采用精确概率法的双侧χ2检验，P＜0.05有统计学差异。

结 果 与形态正常组相比，头部畸形组的受精率（42.86VS64.58）、2PN 受精率（36.73VS60.42）显著性下降（P＜0.05），但对胚胎发育的影响无显著性差异；颈部畸形组的受精率、胚胎发育都无显著性下降；尾部畸形组的受精率（54.17VS 64.58）下降，但无统计学意义，该组胚胎发育无显著性下降。

讨 论 精子在男性睾丸中产生，在附睾中成熟，经输精管运输至精囊并储存其中，以性交、遗精、手淫取精等方式排出体外。精子发生及成熟过程中发生形态异常机制可能有：活性氧产生的增多、精子的异常凋亡、染色质异常、免疫性损伤。精子头部是遗传物质所在部位。尾部主要成分是细胞质，在自然受精过程，主要起运动功能。颈部是连接头部和尾部的结点，具体功能尚未清楚。谢文燕等研究表明人精子染色质的状态与其形态明显相关，头部形态异常的精子其染色体异常的几率要比正常精子染色体异常的几率高4倍[4]。精子畸形率高的患者行IVF 时，其受精率、流产率降低，然而杨帆等[5]报道挑选正常形态的精子行ICSI 时受精率、胚胎发育与正常形态率的精子无差别，但形态异常精子使受精率和临床妊娠率均低于精子形态正常的患者。目前对精子形态异常对辅助生殖技术的影响，国内外报道尚未一致，多数研究结果[6]表明，基于形态学和功能的精子优选技术有理论上的价值，但对于ICSI 的临床结局并没有显著的改善。

附表 睾丸精畸形部位对ICSI受精及胚胎发育的影响

ICSI 技术影响因素很多，本实验在确保其他条件相同的情况下，研究睾穿精子的不同畸形部位对复苏卵子ICSI 受精及胚胎发育的影响。卵子经过冷冻、液氮低温保存、复苏后，受精率及胚胎质量不及新鲜卵子，冷冻复苏过程对卵子造成一定程度损伤。有学者认为睾丸精子受精率比附睾精子低，但睾丸、附睾及射出精子ICSI 后妊娠结局无显著差异，可能存在后期自我修复[7]。在临床工作中，睾丸穿刺所获得的精子未经过附睾等部位的发育与成熟，精子活动力、活动率差，精子密度低，畸形率极高，对于部分患者挑选出一条形态正常的活精子十分困难。因此在睾丸穿刺术+ICSI 术临床应用中，我们尽可能挑选形态正常的活动精子注入，但如果找不到正常形态的活精子，可首先挑选颈部畸形的精子，其次再挑选尾部畸形的精子，最后再考虑头部畸形的精子，以减少精子形态对受精、胚胎的影响。

［1］PALERMO G,JORI H,DEVROEY P,et al.Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoom into an oocyte[J]．Lancet,1992,340,17-18.

［2］严阿勇，李明，安晓荣，等．胞浆内精子注射技术生产小鼠[J]．生物工程学报，2005,21(2)：305-309.

［3］World Health Organization.WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5th ed[M]．Geneva：World Health Organization,2010.66-67．

［4］谢文燕．畸形精子症精液的处理方法及精子形态对辅助生殖技术治疗结局影响的研究[D]．汕头：汕头大学，2007.

［5］杨帆．精子形态对辅助生殖结果影响的相关研究[D]．河北：河北医科大学，2014.

［6］胡烨，滕晓明．精子优选技术的进展及其对卵细胞质内单精子注射结局的影响[J]．诊断学理论与实践，2014,13(3)：341-344.

［7］朱海波．精子质量相关因素对ICSI 助孕结局影响的初步分析[D]．吉林：吉林大学，2014.