125例成人急性髓系白血病免疫表型特点分析

王会芳，苏显都，于彩霞，王家坡，王国增，王丽丽，张 硕，李丽霞，李 健

1河北省涿州市医院 检验科，河北涿州 072750；2海南省农垦那大医院 检验科，海南那大 571700；3解放军总医院 检验科，北京 100853

125例成人急性髓系白血病免疫表型特点分析

王会芳1，苏显都2，于彩霞1，王家坡1，王国增1，王丽丽1，张 硕1，李丽霞1，李 健3

1河北省涿州市医院 检验科，河北涿州 072750；2海南省农垦那大医院 检验科，海南那大 571700；3解放军总医院 检验科，北京 100853

目的探讨成人急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，AML)患者的免疫表型特点及临床意义。方法2011年5月- 2014年6月在河北省涿州市医院和解放军总医院就诊的125例成人AML患者为研究对象，采用多色流式细胞术，以CD45/SSC双参数散点图设门，对其骨髓进行免疫表型检测。结果AML患者髓系特异性抗原表达阳性率依次为CD13(90.4%)、CD33(86.4%)、MPO(80.0%)、CD117(73.6%)；CD14和CD15主要在M4和M5中表达，CD64和CD15同时强阳性伴HLA-DR高表达，提示M5可能性大；在M3患者中有较强的自发荧光，表达髓系抗原CD13、CD33和MPO，低表达CD34和HLA-DR。造血干/祖细胞标记抗原CD34、HLA-DR、CD38在AML中呈高表达，分别为53.6%、70.4%、71.2%。125例中56例伴有淋系抗原表达，各抗原表达率依次为CD56(25.6%)、CD7(19.2%)、CD19(9.6%)、CD4(7.2%)、CD2(6.4%)。有淋系抗原表达(LymAg+)组表达CD34+比例和肝脾大患者比例明显高于无淋系抗原表达(LymAg-)组(P＜0.01)。伴有CD7+患者完全缓解(CR)率明显低于CD7-患者(P＜0.05)，而伴有淋系抗原表达的AML患者CR率(55.6%)与未伴有淋系抗原表达的AML患者CR率(76.2%)差异无统计学意义(P＞0.05)。结论AML患者高表达CD13、CD33、MPO，部分患者同时表达髓系、淋系抗原；伴有CD7+表达的患者，化疗后CR率低，预后较差。

急性髓系白血病；流式细胞术；免疫表型

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是血液系统恶性疾病，骨髓被髓系白血病细胞代替，失去分化成熟潜力。AML的法美英(FAB)分型存在着个人主观因素、细胞形态的多样性等局限性。随着流式细胞术(flow cytometry，FCM)的广泛应用，免疫学分型对白血病分型的诊断尤为重要[1-4]。它可以全面、特异、准确地检测出白血病细胞抗原的分布情况，对白血病的诊断、治疗及预后分析具有重要意义。本研究对125例初诊成人急性髓系白血病患者应用多色流式细胞术CD45/ SSC双参数散点图设门方法进行免疫表型分析，探讨各种类型AML表型分化抗原的表达特点及意义。

对象和方法

1研究对象 2011年5月- 2014年6月于河北省涿州市医院和解放军总医院就诊的125例初诊成人AML患者，骨髓经瑞氏-吉姆萨染色及各种组化染色，分子生物学、免疫学、遗传学检测最终确诊为AML。诊断标准参照天津标准和FAB标准，其中男性67例，女性58例，中位年龄40.2(26 ～82)岁。按FAB分类M112例、M247例、M325例、M414例、M518例、M64例、M75例。125例均行骨髓穿刺(bone marrow aspiration，BMA)及流式细胞术检测。

2主要仪器和试剂 流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司的FACSCalibur。所用单克隆抗体包括多甲藻叶绿素蛋白标记的CD45、异硫氰酸荧光素、别藻青蛋白或

藻红蛋白标记CD34、CD10、CD19、CD9、CD2、CD14、CD13、HLA-DR、CD33、CD7、CD3、CD38、CD117、CD64、CD56、CD15、CD20、髓过氧化物酶、CD22、CD4、CD41及同型对照IgG等，以上试剂均购自美国Becton Dickinson公司。

3方法 根据AML患者中各抗原表达情况分组，其中有淋系抗原表达(LymAg+)56例，无淋系抗原表达(LymAg-)69例；并分析抗原CD7+和CD7-组，LymAg+和LymAg-组，CD34+和CD34-组，CD56+和CD56-组，CD19+和CD19-组与AML患者完全缓解率的关系。采用四色直接免疫荧光法和骨髓涂片检查，分析AML患者细胞形态及免疫表型特点。

4流式细胞分析 取肝素抗凝骨髓标本3 ml，24 h内上机检测。将每个试管中加入肝素抗凝骨髓或外周血(1×106/ml)100μl及四色直接标记荧光抗体，室温避光孵育20 min，再向各试管中加入溶血素500μl，震荡置室温避光，10 min后用500μl PBS洗涤细胞1次，加入500μl PBS重悬细胞。测定前以标准校正荧光微球校正仪器，用流式细胞仪Cell Quest软件获取并分析50 000个细胞，对数取样，CD45/SSC设门选中幼稚细胞群体，再对幼稚细胞群体进行分析，检测各种抗原的表达率。阳性判断标准：抗原CD3/MPO/CD34≥10%，其他抗原≥20%。

5统计学处理 实验数据采用SPSS17.0统计软件处理，正态分布资料以±s表示，两组间比较采用独立样本的t检验或Mann-Whitney检验；计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1CD45/SSC设门的FCM检测结果 125例成人AML患者免疫表型(图1)证实白血病细胞比例为50.7% ～ 92.8%，与骨髓形态学(图2)检查结果(53.2% ～ 96.4%)基本一致，在允许误差范围内(＜5%)。

图 1 1例AML患者骨髓细胞 CD45/SSC 散点图Fig. 1 Scatter plot of BM cells CD45 in a AML patient P1: group of blast cells; P2: lymphocytes; P3: monocytes; P4: neutrophils)

图 2 AML患者骨髓细胞形态Fig. 2 BM cell morphology of AML patients

2AML患者的造血干/祖细胞标记抗原及髓系抗原表达 造血干/祖细胞标记抗原CD34、HLADR、CD38在AML中呈高表达，分别为53.6%、70.4%、71.2%；但M3中CD34、HLA-DR表达明显低于其他亚型(P＜0.05)。在25例M3中CD9、CD13、CD33、CD117、CD64和MPO表达均明显高于CD34和HLA-DR(P＜0.05)。125例中主要表达髓系抗原CD13、CD33、MPO和CD117，分别为90.4%、86.4%、80.0%和73.6%。CD14和CD15主要在M4和M5中表达；CD64主要在M5、M3、M4、M2中表达，分别为72.2%、68.0%、57.1%、46.8%；CD64和CD15同时阳性表达多见于M4和M5。CD41在7例M7中有5例表达，而在M1～ M6中未见表达。见表1。

3AML患者淋系抗原表达 125例中56例伴有淋系抗原表达，阳性率为44.8%；以CD56表达最高占25.6%，其次为CD7(19.2%)、CD19(9.6%)、CD4(7.2%)、CD2(6.4%)，CD3、CD20、CD22无表达。除M3和M7外，其他AML亚型中均可见CD7不同程度表达。CD56在AML各亚型中均有表达，多见于M1和M5。另外2个淋系相关抗原共表达也可见，CD7+和CD56+共表达者6例，CD19+和CD56+共表达者3例，CD7+和CD4+共表达者2例、CD56+和CD4+共表达者2例。见表2。

4AML患者LymAg+组和LymAg-组临床特征比较

根据淋系抗原(LymAg)表达情况，将125例成人AML患者分为LymAg+组(56例)和LymAg-组(69例)。LymAg+组表达CD34+比例和肝脾大患者比例明显高于LymAg-组(P＜0.01)；而两组间平均年龄、性别、血红蛋白水平、白细胞数、血小板数、骨髓原始细胞百分比及抗原CD38+比较均无统计学差异(P＞0.05)。见表3。

5免疫表型与预后的关系 125例中90例接受治疗，有13例放弃治疗。20例对症支持治疗延缓生命，2例临床死亡(均为M3患者)。CD7+组CR率(38.1%)明显低于CD7-组(84.1%)，差异有统计学意义(P＜0.05)。尽管LymAg+、CD34+、CD56+、CD19+组CR率均低于其对应的阴性组，但差异无统计学意义(P＞0.05)。见表4。

表1 AML患者造血干/祖细胞标记抗原及髓系抗原表达Tab. 1 Hematopoietic stem / progenitor cells labeled antigen and myeloid antigen expression in AML patients

表2 AML患者淋系抗原表达Tab. 2 Lymphoid antigen expression in AML patients

表3 LymAg+组和LymAg-组临床特征比较Tab.3 Comparison of clinical features in LymAg+group and LymAg-group

表4 免疫表型与完全缓解率的关系Tab.4 Relationship between immunophenotype and complete remission

讨 论

随着单克隆抗体及流式细胞仪的应用，免疫分型在急性白血病的诊断、治疗和预后中具有重要的作用。根据FAB标准，以细胞形态学和细胞化学染色为依据，其诊断准确率仅为60% ～ 80%[5-7]，而免疫分型诊断准确率可达90%左右。另外，免疫分型可以反映FAB分型无法显示的一些生物学特性，如双表型及急性淋巴细胞白血病的分期等，这些都与治疗方案制订和预后判断有关。我们采用CD45/SSC设门法，来区别正常细胞和白血病细胞，并根据CD45表达的水平来鉴别白血病细胞的异质性。

通过分析125例成人AML患者免疫表型结果显示，主要表达髓系抗原CD13、CD33、MPO、CD117，其中最常见的抗原表达是CD13和CD33，因此CD13和CD33对判断白血病细胞是否为髓系来源时具有很高的诊断价值。M3患者的免疫表型有一定特性，CD13、CD33、MPO高表达，CD34、HLA-DR很少表达，与文献报道基本一致[8-10]。另外，CD9在M3患者中呈高表达，阳性率为72.0%，以上分型特点在M3与其他亚型AML的鉴别诊断中具有很好提示作用。CD34是一个阶段特异而非系特异的抗原，反映细胞的分化处于较早期阶段。CD14作为单核细胞的特异标记，敏感性较差，在M4和M5中常缺乏表达或弱表达。本研究中CD14在M4和M5的阳性率仅为28.6%、33.3%，这可能是由于CD14主要表达于成熟单核细胞、弱表达于幼单核细胞，而原始单核细胞表面很少表达，因此对其诊断应结合其他单克隆抗体、细胞化学染色、遗传学和分子生物学综合分析。M5主要表达CD64、CD15和HLA-DR，阳性率分别为72.2%、88.9%、94.4%，与文献报道相似[11]。这表明CD64和CD15同时强阳性伴HLA-DR高表达提示M5可能性大。CD117主要表达于正常的造血干细胞或髓系干祖细胞。有研究显示，CD117在AML患者中的表达明显高于ALL患者，其髓系特异性好于CD13、CD33[12]。本研究中73.6%的AML患者表达CD117，主要是M1(91.7%)、M2(85.1%)和M5(72.2%)，与国内报道相似[13]。对于M3患者CD117的表达，目前尚存不同观点，本研究中M3高表达CD117(80.0%)，与Zheng等[14]报道的结果基本一致。在7例M7患者中有5例表达CD41，阳性率为71.4%，但CD41除表达于巨核细胞外，也能跟血小板结合，另外，血小板极易和白血病细胞黏附，造成假阳性。因此M7免疫分型特征有待进一步研究。

关于AML患者淋系抗原表达情况，发现56例AML细胞表面有淋系抗原的表达，阳性率为44.8%，其中以CD56、CD7较常见。CD7抗原并非T淋巴细胞的特异性标记抗原，多能干细胞、髓系干细胞与微分化型AML细胞等均可表达CD7抗原。本研究中，CD7的阳性率为19.2%，主要表达于M1，其次是M5、M4、M2，与文献报道基本一致[15-16]。CD7+表达的AML患者CR率明显低于CD7-表达的患者(P＜0.05)。这提示CD7+表达的AML患者预后较差。CD56主要在自然杀伤(natural killer，NK)细胞和部分T细胞表面上表达，是NK细胞特异性分化抗原，与细胞黏附有一定关系。有文献报道15% ～ 35%的AML患者可表达CD56[17]，主要在M1、M2、M5中表达。本研究中CD56的阳性率为25.6%，在M5中表达最高，其次是M1和M2，多伴CD13、CD33、CD34和HLA-DR表达。这提示CD56+的AML是一种分化程度较差的白血病。尽管CD56+的AML患者CR率低于CD56-，但两者差异无统计学意义(P＞0.05)，与文献报道不一致[18]，这可能与各研究的病例数或所使用的单克隆抗体来源不同有关。CD19是B系淋巴细胞的特异性分化抗原，但有研究发现在AML中也有异常表达。本研究中AML患者表达CD19的阳性率为9.6%，尽管CD19+的AML患者CR率低于CD19-，但两者差异无统计学意义(P＞0.05)。另外，LymAg+组表达CD34+比例和肝脾大患者比例明显高于LymAg-组(P＜0.01)，而其他临床特征在两组间差异无统计学意义(P＞0.05)。淋系分化抗原表达在AML患者中的预后意义存在不同观点，这可能与方法学、研究的样本量以及治疗方案等的差异有关。

总之，FCM免疫分型可以分析白血病细胞的来源和所处的分化阶段，提高急性白血病分型的准确性，更好地指导治疗及判定预后。

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Acute myeloid leukemia by flow cytometry immune phenotypic: A characteristics analysis of 125 cases

WANG Huifang1, SU Xiandu2, YU Caixia1, WANG Jiapo1, WANG Guozeng1, WANG Lili1, ZHANG Shuo1, LI Lixia1, LI Jian3

1Department of Clinical Laboratory, Zhuozhou City Hospital, Zhuozhou 072750, Hebei Province, China;2Department of Clinical Laboratory, Nongken Nada Hospital, Nada 571700, Hainan Province, China;3Department of Clinical Laboratory, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

LI Jian. Email: hemthm@yahoo.com

ObjectiveTo investigate immune phenotypic characteristics of adult patients with acute myelogenous leukemia (AML) and its clinical significance.MethodsOne hundred and twenty-five adult patients with AML admitted to Zhuozhou City Hospital and Chinese PLA General Hospital from May 2011 to June 2014 were enrolled in this study. The immune phenotype in the 125 cases with AML were detected by multicolor flow cytometry with CD45 / SSC double parameters scatter plot setting as door.ResultsThe positive rate of myeloid specific antigen expression in AML patients were CD13 (90.4%), CD33 (86.4%), MPO (80.0%), CD117 (73.6%). CD14 and CD15 mainly expressed in M4and M5. CD64 and CD15 also showed strongly positive with high expression of HLA-DR which suggested high possibility of M5. A strong autofluorescence, myeloid antigens CD13, CD33 and low expression of CD34, MPO and HLA-DR were shown in M3patients. Hematopoietic stem/progenitor cell marker antigen CD34, HLA-DR and CD38 were highly expressed in AML with the rate of 53.6%, 70.4% and 71.2%. Of the 125 cases, 56 cases showed leaching antigen expression with the expression rate of CD56 (25.6%), CD7 (19.2%), CD19 (9.6%), CD4 (7.2%), CD2 (6.4%), respectively. The expression of CD34+ratio and the proportion of hepatosplenomegaly patients in LymAg+group were significantly higher than LymAg-group (P＜0.05). And the complete remission (CR) rate in patients with CD7+was significantly lower than CD7-patients (P＜0.05). However, there showed no significant difference in the CR rate of AML patients with lymphoid antigen expression and AML patients without lymphoid antigen expression (55.6% vs. 76.2%, P＞0.05).ConclusionAML patients show high expression of CD13, CD33, MPO, and part of AML patients also show expression of myeloid and lymphoid antigen. Patients with CD7+expression have low CR ratio with poor prognosis.

acute myeloid leukemia; flow cytometry; immunophenotype

R 733.3

A

2095-5227(2015)04-0363-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.04.017

时间：2015-02-10 10:41

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150210.1041.001.html

2014-11-24

保定市科技支撑项目(14ZF010)

Supported by the Key Technology R＆D Program of Hebei Province(14ZF010)

王会芳，女，主管检验师，副主任。研究方向：临床检验诊断。Email: fangzeyu2006@163.com

李健，男，博士，主任医师，副主任。Email: hemthm@yahoo.com