低浓度唑来膦酸对成骨细胞和破骨细胞影响的体外实验

徐小龙，苟文龙，王 程，袁雪凌，王 玉，彭 江，卢世璧，郭全义，汪爱媛，许文静，孟昊业，刘舒云

1解放军总医院 骨科，北京 100853；2第三军医大学大坪医院 骨科，重庆 400042

基础研究论著

低浓度唑来膦酸对成骨细胞和破骨细胞影响的体外实验

徐小龙1，苟文龙2，王 程1，袁雪凌1，王 玉1，彭 江1，卢世璧1，郭全义1，汪爱媛1，许文静1，孟昊业1，刘舒云1

1解放军总医院 骨科，北京 100853；2第三军医大学大坪医院 骨科，重庆 400042

目的观察低浓度(10-6mol/L)唑来膦酸(zoledronate acid，ZA)对体外大鼠破骨细胞及成骨细胞的影响。方法体外分别培养大鼠来源的成骨细胞和破骨细胞，将两种细胞各分为两组：空白对照组及低浓度(10-6mol/L)ZA组。应用抗酒石酸酸性磷酸酶染色、图像分析计算骨吸收陷窝面积，检测破骨细胞形态及骨吸收情况。碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色、四甲基偶氮唑盐比色法了解成骨细胞的形态及增殖情况。结果培养1周后破骨细胞具有典型的形态特征，并在骨片上形成了吸收陷窝；ZA组与对照组相比，破骨细胞数量及生成吸收陷窝的数目和面积减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。成骨细胞有典型的梭形、ALP染色阳性特征，培养至第7天ZA组成骨细胞光吸收值(3.37±0.11)高于对照组(2.87±0.12)，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论低浓度(10-6mol/L)的ZA能够抑制破骨细胞的增殖和活性，促进成骨细胞的增殖，选择恰当给药方式和剂量能够在抑制破骨的同时促进成骨。

唑来膦酸；成骨细胞；破骨细胞

唑来膦酸(zoledronateacid，ZA)是目前最强效的含氮双磷酸盐，现已广泛用于治疗以过度骨吸收为特征的疾病，包括骨质疏松、骨髓瘤、骨转移瘤、Perthes病等。目前，对ZA的研究大多是针对破骨细胞进行的，其对破骨细胞的抑制作用也得到了广泛的认同。但越来越多的研究证明，双膦酸盐具备促进成骨细胞增殖和分化的能力，但这种作用具有浓度依赖性：即10-9～ 10-6mol/L的较低浓度双膦酸盐可以促进成骨细胞的生长和分化，但是＞10-5mol/L时就会有抑制作用[1-3]。然而这种作用尚存在争议。本文在外培养大鼠的成骨细胞和破骨细胞，研究强效的含氮双磷酸盐ZA对大鼠来源的成骨细胞和破骨细胞的影响，以探讨及作用机制。

材料和方法

1试剂与仪器 唑来膦酸、四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)购自Sigma公司；核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κβ ligand，RANKL)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)购自Abcam公司；胰蛋白酶、DMEM培养液购自Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司；抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrateresistant acid phosphatase，TRAP)染色试剂盒、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色试剂盒购自Sigma公司；CO2培养箱购自Hereus公司；磨片机购自MetaServ®Buehler公司；酶标仪购自BIO-RAD公司。

2药物配制及分组 唑来膦酸粉剂(100 mg/瓶，Sigma公司)用磷酸盐液溶解，滴加0.1 mol/L NaOH，pH值滴定至7.4，储备液浓度为10-2mol/L，封装后，Gamma射线辐照灭菌，-20℃冰箱保存。用前加入培养液稀释至所要求的实验终浓度10-6mol/L。

3骨片的制备与处理制备骨片 用以计算破骨细胞骨吸收陷窝面积，研究其破骨作用。取新鲜牛股骨，切割至厚度50 μm的薄切片，再分别用磨片机磨成10 μm厚，5 mm×5 mm大小的骨片，超声清洗后，Gamma射线辐照灭菌，4℃冰箱保存。

4破骨细胞及成骨细胞的培养 从解放军总医院实验动物中心购买10只2周龄雄性SD大鼠。破骨细胞培养：在CO2室处死后，于无菌条件下将大鼠的肱骨及股骨剥离至无菌培养皿中，去除周围组织及干骺端后，用1 mm注射器吸取无菌PBS冲洗髓腔，将混合液于800 r/min，离心5 min，用含10 ng/ml M-CSF的DMEM培养24 h后，计数，并用含有100 ng/ml M-CSF和50 ng/ml RANKL的DMEM重悬，接种于12孔板及含有骨片的六孔板中，每3 d更换1次液体。成骨细胞培养：无菌条件下取其颅盖骨，剔除周围组织，加入0.25%胰酶，37℃消化30 min，后用PBS反复冲洗3次后，加入0.1%的Ⅱ型胶原酶，37℃恒温消化1 h，终止反应后，用DMEM将其重悬，计数并接种于培养瓶中，每3 d更换1次培养液。

5实验分组 1)破骨细胞接种在12孔板及6孔板，每组各10孔，实验组给予含有10-6mol/L ZA的DMEM培养液，对照组加入含等量磷酸酸盐溶液的DMEM培养液，每3 d换1次液体。培养5 d后TRAP染色观察破骨细胞的形态并进行计数，7 d后甲苯胺蓝染色观察骨陷窝，并进行骨陷窝计数和面积分析。2)成骨细胞在培养至第3代接种于12孔板和96孔板后，实验组与对照组分别给予含有10-6mol/L ZA的DMEM培养液和等量磷酸盐溶液的DMEM培养液，每3 d换1次液体。成骨细胞接种于96孔板后中行MTT检测增殖情况，在12孔板培养7 d后，行ALP染色观察成骨细胞形态。

6MTT检测10-6mol/L ZA作用下成骨细胞的生长将传至第3代的成骨细胞接种于96孔培养板，每孔加入100μl细胞悬液(5×103/孔)，每板分3组，每组5个复孔，共4板。37℃，5% CO2箱内培养24 h，分别在各组中加入含等量磷酸盐溶液DMEM培养液，含10-6mol/L ZA培养液及二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶液各100 μl。分别于加药后1 d、3 d、5 d、7 d取1板进行MTT检测，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，继续培养4 h后终止培养，弃去培养液，每孔加入150 μl DMSO，震荡10 min，酶标仪在490 nm处检测各组的光吸收(optical density，OD)值，并以时间为横轴，OD值为纵轴绘制生长曲线。

7统计学处理 使用SPSS13.0统计软件，所有数据用表示，所有定量数据资料均经过正态性检验，定量数据的组间差异性检验采用成组设计的t检验或秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1成破骨细胞形态的观察和鉴定 成功诱导培养出具有多核的、细胞质丰富的、TRAP阳性的破骨细胞，以及具有饱满、梭形、细胞质内有颗粒状沉淀的成骨细胞(图1)。

2ZA对破骨细胞生成及骨吸收功能的影响 对TRAP阳性细胞进行计数发现，ZA组破骨细胞数(13.9±1.7)低于空白对照组(23.7±2.5)，差异具有统计学意义(图2，P＜0.05)。骨吸收陷窝为椭圆形或梅花形淡蓝色陷窝(图3)；ZA组骨吸收陷窝数目及面积低于空白对照组，差异有统计学意义(P＜0.05，表1)。

表1 骨吸收陷窝及骨吸收陷窝面积的比较Tab. 1 Quantitative analysis of the number of osteoclastic bone resorbing lacunae and the area of osteoclastic bone resorbing lacunae (, n=10)

表1 骨吸收陷窝及骨吸收陷窝面积的比较Tab. 1 Quantitative analysis of the number of osteoclastic bone resorbing lacunae and the area of osteoclastic bone resorbing lacunae (, n=10)

aP＜0.05, vs control group

Control group (n=10)ZA group (n=10)tP Number of bone resorption lacunae (n)29.44±13.117.06±1.7a2.9640.008 3 Area of bone resorption lacunae (μm2)493.74±53.1322.74±63.6a6.5270.000 0

3ZA对成骨细胞的影响 与对照组相比，ZA组成骨细胞吸光度随时间延长而逐渐增加，至第7天时，实验组OD值(3.37±0.11)较对照组(2.87±0.12)有统计学差异(P＜0.05，图4)。

图 1 成破骨细胞特殊染色 A： 破骨细胞TRAP染色(IHC×100)； B： 成骨细胞 ALP染色(IHC×100)图 2 甲苯胺蓝染色显示骨吸收陷窝(IHC×200)Fig. 1 Special staining of osteoblasts and osteoclasts A： TRAP staining (IHC×100); B： ALP staining (IHC×100)Fig. 2 Toluidine blue staining showing bone resorption lacunae (IHC×200)

图 3 两组破骨细胞计数比较 (aP＜0.05)Fig. 3 Comparative analysis of the number of osteoclasts between two groups (aP＜0.05)

图 4 两组成骨细胞增殖曲线比较Fig. 4 Comparative analysis of the proliferation curves of osteoblasts between two groups

讨 论

双膦酸盐对骨的高选择性使得他们能有效地作用于与骨紧密结合的破骨细胞[4-5]。大量研究已经表明，双膦酸盐可能会通过各种方式影响破骨细胞的功能，包括破骨细胞的招募，分化和骨吸收活性，并且可能会导致破骨细胞的凋亡[6]。ZA是强效的含氮双磷酸盐，是可在细胞内抑制破骨细胞内甲羟戊酸通路中的关键酶，使得维持破骨细胞功能的小GTP酶合成减少，影响破骨细胞的分化和生长[7-8]。本研究表明，在低浓度(10-6mol/L) ZA的作用下，离体培养的破骨细胞的数量、骨吸收陷窝个数及骨吸收陷窝面积与对照组相比减少，差异有统计学意义。证明ZA不但能抑制破骨细胞的增殖，还能有效地抑制破骨细胞的功能，从多个方面证明ZA对于破骨细胞的抑制作用，这与Sato和Grasser[9]、Weinstein等[10]及Kimachi等[11]的研究结果类似。

双膦酸盐对破骨细胞的作用已被广泛认同，而其对骨细胞和成骨细胞的作用仍存在争议。有研究表明，双膦酸盐可通过连接蛋白43(Cx43蛋白)形成的通道抑制成骨细胞的凋亡[12]。Cx43蛋白是一种表达在成骨细胞和骨细胞的连接蛋白，Cx43蛋白半通道的打开，激活了“细胞外信号调节激酶”，从而启动激活了p90RSK的激酶的顺序磷酸化，并最终作用于BAD和C/EBPβ，从而抑制细胞凋亡。本研究发现，低浓度(10-6mol/L)的ZA能对离体培养的成骨细胞没有毒性，并且能起到促进其增殖的作用，这与Jeong等[13]、Ho[14]的研究相类似。

本研究为ZA的细胞学作用机制提供了依据。本实验的局限在于，在离体培养无法准确模拟体内释放ZA的过程和剂量，所以还需进一步的动物实验进行验证。

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Effects of low concentration of zoledronic acid on osteoclasts and osteoblasts in vitro

XU Xiaolong1, GOU Wenlong2, WANG Cheng1, YUAN Xueling1, WANG Yu1, PENG Jiang1, LU Shibi1, GUO Quanyi1, WANG Aiyuan1, XU Wenjing1, MENG Haoye1, LIU Shuyun1

1Department of Orthopedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Department of Orthopedics, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China

PENG Jiang. Email: pengjiang301@126.com

ObjectiveTo explore the effects of low concentration (10-6mol/L) of zoledronic acid (ZA) on osteoclasts and osteoblasts.MethodsOsteoclasts and osteoblasts were obtained from neonatal rats and cultured in vitro, and they were divided into control group and ZA group. TRAP staining and image analysis were used to detect the proliferation and activity of osteoclasts. ALP staining and MTT were used to detect the morphological characteristics and proliferation of osteoblasts.ResultsAfter a week, osteoclasts showed typical morphological characteristics, and bone resorption lacunas were found in vitro. Compared with control group, the number of osteoclasts and lacunae (P＜0.05), and the area of lacunae (P＜0.05) in ZA group were significantly decreased. Osteoblasts showed typical fusiform and ALP showed positive staining characteristics. The optical density of osteoblasts was dramatically higher in ZA group (3.37±0.11) than control group (2.87±0.12) on day 7 after being cultured, and it had significant difference (P＜0.05).ConclusionThe low concentration (10-6mol/L) of ZA can inhibit proliferation and activity of osteoclasts and promote the proliferation of osteoblasts. Therefore, it is important to choose right administration and dose of ZA to enhance the osteogenesis and inhibit the bone resorption.

zoledronic acid; osteoblasts; osteoclasts

R 96

A

2095-5227(2015)04-0371-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.04.019

时间：2015-01-05 10:39

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150105.1039.001.html

2014-10-20

国家“863”计划项目(2012AA020502)；全军十二五重点项目(BWS11J025)；国家“973”重点基础研究发展规划项目(2012 CB518106)

Supported by “863” Program of China(2012AA020502); Military Medical Research "12th Five-Year Plan"General Program of China(BWS11J025); National “973” Program for Basic Research of China(2012CB518106)

徐小龙，男，在读硕士。研究方向：骨坏死。Email: Xu xiaolong0609@163.com

彭江，男，副主任医师，教授，硕士生导师。Email: pe ngjiang301@126.com