两种卵巢切除术式建立大鼠骨质疏松模型的优势比较

李 明，吕厚辰，尹鹏滨，李瑞生，张里程，唐佩福，张立海

1解放军总医院 骨科，北京 100853；2解放军第302医院 动物实验中心，北京 100039

两种卵巢切除术式建立大鼠骨质疏松模型的优势比较

李 明1，吕厚辰1，尹鹏滨1，李瑞生2，张里程1，唐佩福1，张立海1

1解放军总医院 骨科，北京 100853；2解放军第302医院 动物实验中心，北京 100039

目的对比两种卵巢切除术式建立大鼠骨质疏松模型的便捷性及安全性。方法40只3月龄雌性SD大鼠随机均分为2组，背侧部双切口手术组(OVX 1，n=20)、腹部正中切口手术组(OVX 2，n=20)分别进行相对应卵巢切除术，对比两种术式手术用时、出血量、术后并发症及骨密度(bone mineral density，BMD)情况。结果OVX 1组与OVX 2组手术平均时间分别为(26.35±7.55) min和(30.95±6.39) min，OVX 1组较OVX 2组手术时间短(P＜0.05)。OVX 1组与OVX 2组平均出血量分别为(1.81±0.81) g和(1.82±0.77) g，差异无统计学意义(P＞0.05)。OVX 1组与OVX 2组术者操作成长曲线(大鼠数量-手术时间，大鼠数量-手术出血量)均呈现负性相关(r=-0.846 8，P=0.000，r=-0.788 2，P=0.000；r=-0.903 4，P=0.000，r=-0.891 2，P=0.000)。OVX 2组1例术后切口开裂感染，两组大鼠均未出现死亡情况，OVX 1组术前与术后3个月第5腰椎平均骨密度分别为(0.376±0.021) g/cm2和(0.264±0.026) g/cm2，OVX 2组为(0.371±0.016) g/cm2和(0.275±0.019) g/cm2，BMD均明显降低(P＜0.05)。3个月后两组大鼠剖腹探查发现，OVX 1组无腹腔粘连，OVX 2组腹腔粘连严重。结论背侧部双切口卵巢切除术建立大鼠骨质疏松模型操作更为简便、手术用时少、安全性高。

动物模型；大鼠；骨质疏松；卵巢切除术

目前，去卵巢手术建立大鼠绝经后骨质疏松模型是骨质疏松基础研究经常采用的方法[1]。由于大鼠在雌激素缺乏后骨代谢变化情况与人相似，因此其在骨质疏松病因学、病理生理学、诊断学、治疗药物药代动力学及预防学等方面具有较高的研究价值[2-4]。大鼠绝经后骨质疏松模型常用的建立方法为卵巢切除术，手术方式主要有背侧部双切口与腹部正中切口两种。在既往研究中两种术式都有较为广泛的应用，但是在手术操作的便捷性、安全性及建模效果方面孰优孰劣并无系统报道[5-6]。故本文在前期开展大鼠骨质疏松相关研究的基础上，对比了背侧部双切口与腹部正中切口两种术式，并详细介绍了大鼠去卵巢建立骨质疏松模型的操作步骤，归纳了术后特殊注意事项，为进行相关建模工作的同行提供参考。

材料和方法

1实验动物 3月龄健康雌性SD大鼠40只，体质量(265±30)g，由解放军第302医院动物实验中心提供。大鼠分笼饲养于室温24℃，日照12 h，相对湿度45% ～ 55%，通风良好的环境中，饲喂大鼠专用饲料，由解放军第302医院动物实验中心提供，自由饮水，适应环境2周后开始实验。采用单纯随机对照实验方法，将40只大鼠按体质量大小编号，进行完全随机分组，将40只大鼠随机平均分为OVX 1及OVX 2组。

2药品与器械 麻醉药物(1%戊巴比妥钠)，碘伏，75%酒精，青霉素G 5×106IU/瓶，新洁尔灭，100 ml 0.9%氯化钠注射液。手术刀，手术剪，眼科剪，手术镊，组织钳，止血钳，缝合针，医用慕斯线3-0/T，纱布，棉球。

3背侧部双切口入路去卵巢手术 大鼠腹腔注射0.1%戊巴比妥钠溶液(45 mg/kg)麻醉。取俯卧位固定，于背部后正中线旁开1.5 cm，双侧肋缘下1.5 cm处为中心，半径为1.5 cm备皮，分别用碘伏和酒精于术部消毒(图1A)，覆盖无菌铺单，以背部后正中线旁开1.5 cm，双侧肋缘下1 cm为切口，向下切开皮肤1 ～1.5 cm，钝性分离皮下组织，切开肌层，暴露腹腔，切口视野可见白色脂肪，拨开脂肪，可见脂肪包裹呈粉红色桑葚状的卵巢(图1B)，轻柔分离卵巢下输卵管与脂肪，用组织钳夹闭卵巢下输卵管，将输卵管用慕斯线结扎，剪除卵巢(图1C)，将断端输卵管送回腹腔，间断缝合肌层、皮肤，用碘伏再次消毒皮肤缝合口(图1D)。同法切除另一侧卵巢。术后于大鼠大腿肌肉内注射青霉素G钠盐40 000 IU。

4腹部正中切口入路去卵巢手术 大鼠腹腔注射0.1%戊巴比妥钠溶液(45 mg/kg)麻醉。取仰卧位固定，于腹正中线距离阴道口2.5 cm处为中心，半径1.5 cm备皮，分别用碘伏和酒精于术部消毒，覆盖无菌铺单(图2A)，以腹正中线距阴道口3.5 cm处为切口，向下切开皮肤1.5 ～ 2 cm，钝性分离皮下组织，切开肌层、腹膜，打开腹腔，切口视野可见白色脂肪，拨开脂肪层找到子宫，沿着输卵管轻柔拉出，其末端可见脂肪包裹呈粉红色桑葚状的卵巢(图2B)，轻柔分离卵巢下输卵管与脂肪，用组织钳夹闭卵巢下输卵管，将输卵管用慕斯线结扎，剪除卵巢(图2C)，将断端输卵管送回腹腔，行腹腔、肌层全层间断缝合，间断缝合皮肤，用碘伏再次消毒皮肤缝合口(图2D)。同法去除另一侧卵巢。术后于大鼠大腿肌肉内注射青霉素G钠盐40 000 IU。

图 1 背侧部双切口入路去卵巢手术 A： OVX 1配皮消毒区域； B： 暴露桑葚状卵巢； C： 结扎近端输卵管； D： 消毒缝皮Fig. 1 Double dorsal-lateral incision of ovariectomyA: OVX 1 disinfection area of skin; B: exposed ovaries; C: proximal tubal ligation; D: disinfection and sewing leather

图 2 腹部正中切口入路去卵巢手术 A： OVX 2配皮消毒区域； B： 暴露桑葚状卵巢； C： 结扎近端输卵管； D： 消毒缝皮Fig. 2 Midline abdominal incision of ovariectomyA: OVX 2 disinfection area of skin; B: exposed ovaries; C: proximal tubal ligation; D: disinfection and sewing leather

5术后处理 手术完成后将动物置于电暖气旁苏醒，待动物苏醒后放入单笼饲养，笼内铺放无菌垫料，视垫料污染情况及时更换，术后连续3 d密切观察皮肤切口、精神状态及进食进水情况。于术后1 d开始每天注射青霉素G钠盐40 000 IU，共3 d。

6统计学处理 采用SPSS22.0统计软件进行分析，计量数据以表示，行定量数据t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1两组大鼠体质量变化 OVX 1与OVX 2术后3 d，大鼠精神状态良好，期间自由觅食、饮水,各项活动正常,未出现死亡。术前及术后3个月两组大鼠体质量均明显增加(P＜0.01)，两组术前及术后3个月体质量无统计学差异(表1)。

2手术时间 手术时间以皮肤切开起始，双侧皮肤缝合完毕为止，背侧部双切口比腹部正中切口用时短(P=0.044 3，P＜0.05)。OVX 1、OVX 2后5只平均手术时间较前5只明显缩短(P=0.000 1，P＜0.05)，OVX 1后5只平均手术时间较OVX 2用时短(P=0.022 1，P＜0.05)(表2)。OVX 1与OVX 2术者操作成长曲线(大鼠数量-手术时间)呈现负相关。(OVX 1组r=-0.846 8，P=0.000；OVX 2组r=-0.903 4，P=0.000)(图3)。

3手术出血量 手术出血量以纱布术后与术前重量差值为标准(单位g)，两组手术方式出血量差异无统计学意义(P=0.968 3，P＞0.05)。OVX 1、OVX 2后5只手术出血量较前5只明显减少(P=0.000 1，P＞0.01)(表3)。OVX 1与OVX 2术者操作成长曲线(大鼠数量-手术出血量)均呈负相关(OVX 1组r=-0.788 2，P=0.000；OVX 2组r=-0.891 2，P=0.000)(图4)。

4术后并发症 OVX 1术后1周未出现切口感染，OVX 2术后1只出现切口开裂、红肿、脓性分泌物感染迹象，予以单笼饲养，抗生素抗感染治疗后康复。

5骨密度(bone mineral density，BMD)结果 选择双能X线吸收法(DXA)测定骨密度仪(美国Hologic公司)，进行活体大鼠骨密度扫描扫，分别于实验开始时(12周龄)、术后3个月(24周龄)进行扫描。1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，将大鼠呈俯卧位平置在扫描台上，四肢尽量外展，尾部弯曲后置，利用自带的小动物骨密度分析软件分析测定骨密度。每次扫描前均使用由同一厂家提供体模进行质量控制性扫描。OVX 1术前与术后3个月第5腰椎平均BMD均明显降低(P＜0.05)，两种术式3个月后BMD差异无统计学意义(P＞0.05)(表4)。

6大鼠腹腔粘连情况 术后3个月两组大鼠开腹探查发现，OVX 1腹腔情况正常。OVX 2腹腔出现明显粘连，内脏排列较OVX 1组紊乱。

表1 两组大鼠体质量变化情况Tab. 1 Changes of body weight of rats in two groups (g,±s)

表1 两组大鼠体质量变化情况Tab. 1 Changes of body weight of rats in two groups (g,±s)

Group (n=20)Weight of preoperative Weight of postoperative after 3 monthsP OVX 1288.50±17.49363.88±23.560.000 0 OVX 2282.38±9.87365.75±24.260.000 0 P 0.402 80.877 6

表2 两组大鼠手术时间Tab. 2 Operation time of two groups (min,±s)

表2 两组大鼠手术时间Tab. 2 Operation time of two groups (min,±s)

(n=20)Operation timeOperation time of top five ratsOperation time of last five ratsP OVX 126.35±7.5536.60±4.3919.60±3.210.000 0 OVX 230.95±6.3939.40±4.0424.60±2.300.000 0 P0.044 30.753 80.000 0 Group

表3 两组大鼠手术出血量Tab. 3 Blood loss of two groups (g,±s)

表3 两组大鼠手术出血量Tab. 3 Blood loss of two groups (g,±s)

Group (n=20)Blood lossBlood loss of top five ratsBlood loss of last five ratsP OVX 11.81±0.812.86±0.541.12±0.180.000 0 OVX 21.82±0.772.82±0.571.02±0.280.000 0 P0.968 30.821 00.187 1

表4 两组大鼠BMD改变Tab. 4 BMD of two groups (g/cm2)

图 3 大鼠数量-手术时间变化曲线 (OVX 1组 r = -0.846 8， P=0.000；OVX 2组 r = -0.903 4， P=0.000)Fig. 3 Curves of quantity of rats-operation time change (OVX 1 group: r = -0.846 8， P=0.000； OVX 2 group: r = -0.903 4，P=0.000)

图 4 大鼠数量-手术出血量变化曲线 (OVX 1组： r = -0.788 2， P=0.000；OVX 2组： r = -0.8912， P=0.000)Fig. 4 Curves of quantity of rats-blood loss change (OVX 1 group: r = -0.788 2， P=0.000； OVX 2 group: r = -0.8912， P=0.000)

讨 论

建立骨质疏松动物模型在研究骨质疏松发病机制、探讨防治措施和新药研究中占有十分重要的地位。目前获得骨质疏松模型有很多方法，包括低钙饮食、糖皮质激素诱导、制动、去势等方法[7]。自1969年Savile建立绝经后大鼠动物模型以来，去势方法一直被认为是最可靠的建模手段，并且去卵巢大鼠是FDA和WHO推荐的研究绝经后骨质疏松症的经典模型[8]。当前研究多使用3 ～ 10月龄未孕雌鼠且造模持续时间多为12 ～ 24周以建成绝经后骨质疏松模型[9-14]。Jast和Jasiuk[15]用高分辨率micro-CT扫描仪，对3周、12周、32周、42周、60周、72周雌性SD大鼠股骨皮质骨三维结构扫描后发现，随周龄增加，大鼠胫骨骨微结构的变化并不明显，提示3月龄大鼠股骨的骨微结构已发育成熟稳定，不再随发育而发生显著变化，已适合建立去卵巢骨质疏松大鼠模型，故本实验采用3月龄未孕雌性SD大鼠建模。有研究发现，12周龄大鼠分别在去卵巢后6周和8周时股骨骨密度均显著降低，分别降低了26.3%和28.0%[16]。Cao等[17]通过去势法建立大鼠骨质疏松建模，术后12周发现第4腰椎与股骨BMD较假手术组分别减少了23.9%和25.6%。余萍萍等[18]发现大鼠行卵巢切除术后3个月腰椎BMD较假手术组降低了12.6%。王翔等[19]发现3月龄大鼠卵巢切除术后3个月腰椎BMD较对照组降低了18.7%。同样，Wang等[20]发现3月龄SD雌鼠行去势建模术后3个月大鼠第4 ～ 6腰椎平均BMD较假手术组降低了约20%。本实验选择建模持续时间为12周，经DXA测定建模前后腰椎BMD的改变[21]，结果显示，两组BMD均明显降低，OVX 1与OVX 2组第5腰椎BMD分别减少了29.7%和25.9%，降低幅度＞20%，确定此次建模成功。

经过对比，背侧部手术较腹正中切口手术方式用时短，结合大鼠的生理解剖，原因为背侧部切开后直接暴露卵巢，减少手术探查寻找时间。OVX 1与OVX 2前5只手术时间无差异，可能与术者手术操作生疏有关，随着术者手术技术娴熟，OVX 1后5只手术时间较OVX 2明显缩短。此外，背侧部与腹部正中手术方式出血量无差异，原因为大鼠卵巢切除术出血主要发生于剥离卵巢与周围脂肪，皮肤与肌肉切口出血量很少，所以两种术式出血量无明显差异。腹部正中切口有1例出现切口裂口、感染，考虑有以下3点因素：1)缝合不牢，切口开裂，导致感染；2)大鼠腹部与饲养笼底摩擦，缝合线断裂，导致感染；3)大鼠腹部与饲养笼底摩擦，接触自身排泄物，导致感染以致切口开裂。OVX 1与OVX 2术后均未出现休克及死亡情况，原因为术中输卵管结扎牢固，卵巢切除后周围脂肪按压止血，确保无显性出血后，将断端送回腹腔。大鼠术后置于电暖气旁复温，待其麻醉苏醒后置单笼饲养。两种术式随着手术数量的增加，术者手术技术的提高，在手术时间、出血量方面均有下降的趋势。3个月后两组行剖腹探查发现，OVX 1组无粘连，OVX 2组粘连严重，原因为切口入路不同，导致上述情况，腹腔粘连可能会干扰后续腹腔内注射药物及药物吸收情况，故建模后续研究如需腹腔给药，建议行OVX 1术式，降低腹腔粘连对药物吸收干扰。

综上，背侧部双切口卵巢切除术的操作更为简便、手术用时少、安全性高，术中减少输卵管牵拉，不会改变腹腔正常解剖结构，降低术后腹膜粘连机会。娴熟的手术操作及术后精心护理对减少手术时间，降低术后并发症也有着重要的影响。

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Comparison of advantages of two kinds of ovarian resection in establishing osteoporosis model in rats

LI Ming1, LYU Houchen1, YIN Pengbin1, LI Ruisheng2, ZHANG Licheng1, TANG Peifu1, ZHANG Lihai1

1Department of Orthopaedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Center of Animal Experiment, Chinese PLA 302 Hospital, Beijing 100039, China

ZHANG Lihai. Email: zhanglihai74@qq.com

ObjectiveTo compare the simplicity and safety of two operative methods in inducing osteoporosis in rats.MethodsForty 3-month old female SD rats were divided into two groups randomly: OVX 1 group (n=20) and OVX 2 group (n=20). In the first group, ovariectomy was a double dorsal-lateral incision. In the second group, ovariectomy was a midline abdominal incision. Surgical operation time, blood loss, postoperative complications and BMD were compared between two groups.ResultsThe average operation time of OVX 1 group was significantly shorter than that of OVX 2 group (26.35±7.55 min vs 30.95±6.39 min, P＜0.05). The average blood loss of OVX 1 group and OVX 2 group was 1.81±0.81 g and 1.82±0.77 g, respectively, with no significant difference (P＞0.05). The level of surgery time and blood loss were negative correlated with the number of rats in OVX 1 and OVX 2 group (r=-0.846 8, P=0.000, r=-0.788 2, P=0.000; r=-0.903 4, P=0.000, r=-0.891 2, P=0.000). One case in OVX 2 group had complication of incision infection. No rats died in two groups. All rats had undergone Dual X-ray Absorptiometry (DXA) Measurement before and three months after operation. The bone mineral density (BMD) of the fifth lumbar was 0.376±0.021 g/cm2before operation and 0.264±0.026 g/cm2three months after operation in OVX 1 group, and 0.371±0.016 g/cm2and 0.275±0.019 g/ cm2in OVX 2 group, which were significantly reduced (P＜0.05). Rats in OVX 2 group had severe abdominal cavity adhesion after three month.ConclusionThe double dorsal-lateral incision of ovariectomization is technically easier, less time consuming and more safety in establishing the rat model of osteoporosis.

animal model; rats; osteoporosis; ovariectomy

R 681.4

A

2095-5227(2015)04-0383-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.04.022

时间：2015-02-04 10:48

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150204.1048.002.html

2014-10-31

国家自然科学基金面上项目(31370947)；国家自然科学基金青年科学基金项目(8140090663)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(31370947); National Natural Science Foundation for Youth of China(8140090663)

李明，男，在读硕士。Email: liming891215@163.com

张立海，男，博士，副主任医师，副教授，硕士生导师。

Email: zhanglihai74@qq.com