邻苯三酚自氧化法测定血浆超氧化物歧化酶的方法学评价及临床应用探讨

张 凡，李兴武，钟政荣

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是生物体内特异性的清除自由基的首要物质，SOD 水平的高低可反映机体内自由基的含量。常用于对心、脑、肝脏等重要脏器病变引起的过氧化物损伤进行监测［1］。目前对于SOD 的研究十分活跃，SOD 测定方法有多种［2］，如黄嘌呤氧化酶法、邻苯三酚自氧化法、肾上腺素法、核黄素－NBT 法、细胞色素C 还原法等，目前多数实验室此项目的检测多采用黄嘌呤氧化酶法、邻苯三酚自氧化法。我院于2014年3月开展了血浆SOD检测，选用了邻苯三酚自氧化法。为探讨此方法优劣及SOD 的临床应用价值，本文特对邻苯三酚自氧化法测定SOD 进行了实验探讨，进行了相关的方法学评价和比较，现将整个检测过程报告如下。

1 资料与方法

1.1 资料 健康对照组为我院体检中心经健康体检合格的正常人。对照组共42 例，其中男29 例，女13 例，平均年龄42岁。疾病组:选择与氧化应激反应相关疾病患者1580 例，其中肝脏疾病277 例，肾脏疾病281 例，消化系统疾病174 例，呼吸系统疾病133 例，心血管疾病673 例，糖尿病患者42 例。疾病组中，男940 例，女640 例，平均年龄57.9 岁。

1.2 方法(1)仪器:为日本产为Beckman Coulter AU5800全自动生化分析仪。试剂为北京华宇亿康生物工程技术有限公司生产的邻苯三酚自氧化法定量测定试剂盒;校准品和质控品为试剂配套使用，批号为131221 和20140407，均在效期内使用。(2)样本来源:利用质控品、校准品及混合血浆配制相关方法学评价用的样本;(3)试验方法:有以下几种:

1.2.1 精密度试验 依照CLSI 的EP5-A2［3］文件要求，取高、中值质控血浆，其中20 份用于批内精密度试验，即1 d 测定20 次;另外20 份用于做批间精密度试验，即每天分别取高、低值质控各1 支，连续测定20 d。

1.2.2 准确性试验 依照CLSI 的EP9-A2［4］文件的要求，检测SOD 定值标准血清，连续测量3 d，每天测量3 次，计算绝对偏移和相对偏移，和试剂盒准确性标准的要求进行比较。

1.2.3 线性试验 按照CLSI 的EP6 A［5］文件的要求，取批号为131221 的标准品干冻血清，按照试剂盒提供的线性范围，对标准品进行系列浓度的稀释或浓缩，即高(H)、低(L)浓度样品，配制成6 管系列样品:5L、4L+ 1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、5H，分别测定三次取均值。以X 表示各样品的理论值，以Y 表示各样品的实测值进行回归分析，得到Y=bX+a，若r2＞0.95，则可判断线性范围验证成功［5］。

1.2.4 回收试验 在两份新鲜血浆中按比例加入高、低不同浓度的标准液，得到4 份回收血浆，每一浓度均检测3 次，取均值。

1.3 临床应用评价 对氧化应激相关疾病患者及42 名健康体检者进行比较，疾病组分为肝脏疾病组、肾脏疾病组、消化系统疾病组、呼吸系统疾病组、心血管疾病组、糖尿病患者。

1.4 统计学方法 2 组之间比较采用独立样本t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。计量资料以±s 表示。

2 结果

2.1 精密度试验 按要求对标本测定后，然后对结果进行统计学处理。结果显示:批内精密度高、中值的CV%分别为1.57%、1.82%，批间精密度高、中值的CV%分别为2.17%，2.21%，结果均小于5%的临床要求。见表1。

表1 2 组标本的精密度测定结果(U/ml)(CV%，±s)

表1 2 组标本的精密度测定结果(U/ml)(CV%，±s)

项目批内精密度均值及标准差变异系数批间精密度均值及标准差变异系数高值202.30 ±3.181.57212.00 ±4.592.17中值150.05 ±2.741.82152.00 ±3.362.21

2.2 准确性试验 按要求对标本测定后，计算绝对偏移和相对偏移，和试剂盒说明书准确性标准的要求1/4 的进行比较。该血清SOD 测试准确度试验符合相关技术要求和临床实际要求。结果见表2。

表2 SOD 准确度试验结果(n=9)

2.3 线性 对标准品所稀释的6 管系列浓度值做图，理论值为X 轴，实测值为Y 轴，进行回归分析，得出R2为0.9978，在0～250 U/ml 内具有良好线性。见图1。

图1 SOD 线性分析

2.4 回收试验 将2 份基础血清1 ml 分别加入0.1 ml 浓度为250 U/ml 和150 U/ml 的校准液进行测定，分别对基础血清及回收样本进行测定，计算回收率，得出其回收率为96.2%～103.4%，平均回收率为98.7%，见表3。

表3 血清标本回收试验测定结果

2.5 临床应用评价 对疾病组(肝脏疾病、肾脏疾病、消化系统疾病、呼吸系统疾病、心血管疾病、糖尿病患者)分别与正常对照组比较，差异具有显著性(P＜0.01)。表4。

表4 不同疾病血浆SOD 水平与正常对照组的比较(±s)

表4 不同疾病血浆SOD 水平与正常对照组的比较(±s)

组别例数SOD肝脏疾病组277120.98 ±24.27肾脏疾病组281144.79 ±37.44消化系统疾病组173118.00 ±28.22呼吸系统疾病组13395.95 ±18.46心血管疾病组673134.88 ±31.98糖尿病组42121.31 ±30.35正常对照组42178.76 ±15.42

3 讨论

近年来研究表明［6-9］，SOD 用于催化超氧阴离子自由基(O2－)发生歧化反应，它对平衡机体氧化与抗氧化系统、免除自由基损伤起着主要的作用。在病理情况下，自由基产生过多，就会引起DNA、蛋白质和脂类等生物大分子的损伤，引起机体发生多种疾病。人体中自由基含量与SOD 水平呈负相关，SOD 水平的高低可反映机体内自由基的含量。SOD 常用在对心、脑、肝、肾等重要脏器病变以及炎症、放射性损伤、药物中毒、放化疗等引起的过氧化物损伤，并运用自由基清除药物进行治疗。

我院于2014年3月开展了血浆SOD 检测，选用了邻苯三酚自氧化法。从本试验方法学的原理来看，在碱性条件下邻苯三酚能迅速自氧化，释放出O2－，加入SOD 则抑制其自氧化速度，且减弱的程度与SOD 的浓度相关，此反应属于酶促反应，其具有操作简便、快速、试剂便宜且用量小，适用于自动生化分析仪。SOD 测定方法有多种，如黄嘌呤氧化酶法、肾上腺素法、核黄素－ NBT 法、细胞色素C 还原法等，有报道认为［2］，黄嘌呤氧化酶法特异性强，结果稳定，但试剂昂贵，反应时间长。而其他几种方法干扰因素多，稳定性差。

本文遵照美国临床和实验室标准化协会CLSI 文件EP5－A2［3］、EP9－A2［4］和EP6－A［5］的要求对SOD 测定试剂盒进行评价，SOD 不属于常规化学的检测项目，因此对于此类新项目的评价和论证就显得尤重要。从本文的试验结果看，SOD 精密度试验无论是批内还是批间精密度均符合要求。批内精密度为1.57%和4.8%，批间精密度为2.17 和2.21%。本次评价结果满意，反映了实际工作中临床该项目标本随机分配及仪器、试剂天间误差而带来的不确定度。本次试验准确性试验的相对偏倚为:1.6%和2.4%，试剂厂商提供的1/4相对偏倚为5%，表明该试验的准确性好。本次试验所用的校准品是试剂配套的校准品，厂家对其进行了严格的定值，但是由于该项目较新，不属于常规化学的检测项目，所以不同实验室及试验方法间的可比性就有待进一步探讨;本次线性试验，在0～250 U/ml 内R2 为0.9978，表明在0～250 U/ml 范围内该项目线性良好。对于线性试验，关键在于制备高、低浓度的样本，本试验根据厂家提供的校准品配制。本次回收试验的回收率为96.2%～103.4%，表明该实验的系统误差小，完全满足临床检测的需要。本次试验选用了2 份基础血清分别加入2 个浓度的校准液进行测定，目的是为了得到不同医学决定水平的样本，试验结果非常令人满意。

对于本次试验临床应用评价方面，选用了大量的疾病组血清SOD 水平与正常对照进行对比，本次临床标本验证结果表明肝脏疾病、肾脏疾病、消化系统疾病、呼吸系统疾病、心血管疾病以及糖尿病患者的血清SOD 活性水平均低于健康对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)，与有关报道相符［6-9］。在病理状态下，生成过多的自由基或者清除障碍都可引起机体损伤，体内抗氧化物质平衡失调。肝脏能有效的清除体内产生的自由基，抑制或阻止脂质的过氧化反应［10］。本次研究中，肝脏疾病的SOD 活性水平显著低于健康对照组(P＜0.01)。表明体内SOD 水平的确发生了变化，与上述论证相符。对于肾脏疾病和糖尿病患者，本次研究表明患者体内的超氧阴离子过多。另外，本次研究表明在心血管疾病中，体内SOD 水平也显著下降。有报道表明［6］，心血管疾病以心肌缺血为主。心肌缺血时，氧气供应不足，心肌细胞内ATP 分解加速，使黄嘌呤脱氢酶转变为黄嘌呤氧化酶，此酶催化黄嘌呤产生尿酸和大量氧自由基，消耗抗氧化酶。使体内自由基消除剂减少或缺乏。因此，监测SOD 活性水平对与心脑血管疾病的发生、发展和治疗均有积极意义。对于消化系统疾病，SOD 活性水平也显著下降，其原因有报道认为［8］，是消化道黏膜细胞在化学刺激或者机体缺氧等情况下，产生过多的氧自由基而不能及时清除，损伤消化道黏膜细胞.导致消化道疾病组织中SOD 活性水平降低。而对于呼吸系统疾病，本次研究133 例，其中包括肺部感染、肺功能不全、肺气肿、肺炎、肺肿物，肺栓塞等。试验结果表明患者体内自由基含量过多，存在过度氧化情况，与现有报道一致［11］。

综上所述，邻苯三酚自氧化法测定血清SOD 适用于生化分析仪，方法学评价优良，对于肝脏疾病、肾脏疾病、消化系统疾病、呼吸系统疾病、心血管疾病以及糖尿病患者均有价值，对于患者病程转归，实时动态监测以及如何运用氧自由基清除剂等方面开辟了广泛的前景。

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