TPX2在食管胃交界部腺癌中的表达及临床意义

沈亮 许一鸣 丁胜光 仲崇俊

TPX2在食管胃交界部腺癌中的表达及临床意义

沈亮 许一鸣 丁胜光 仲崇俊

目的 研究TPX2在食管胃交界部腺癌组织中的表达，并探讨其临床意义。方法 采用免疫组织化学法分析80例食管胃交界部腺癌、41例癌旁不典型增生组织及48例正常胃黏膜组织中TPX2蛋白的表达；运用RT－PCR法检测TPX2mRNA在40例食管胃交界部腺癌、36例癌旁不典型增生组织和28例正常胃黏膜组织中的表达水平。结果 食管胃交界部腺癌、癌旁不典型增生组织及正常胃黏膜组织中的TPX2蛋白阳性率分别为71．2%（57／80）、53．7%（22／41）和31．2%（15／48），三组间比较差异有统计学意义（χ2＝10．315，P＝0．018）；TPX2mRNA阳性率分别为77．5%（31／40）、69．4%（25／36）和7．1%（2／28），三组间比较差异也有统计学意义（χ2＝7．468，P＝0．025）。TPX2蛋白及mRNA在食管胃交界部腺癌组织中表达的阳性率随着肿瘤浸润深度增加、淋巴结转移和肿瘤分期增高而逐渐增高（P＜0．05），而与性别、年龄及组织分化程度均无关（P＞0．05）。结论 TPX2的异常表达可能是食管胃交界部上皮细胞癌变与浸润转移的重要因素，TPX2的检测有利于食管胃交界部腺癌的早期诊断和预后判断。

TPX2； 食管胃交界部腺癌； RT－PCR； 免疫组织化学

食管胃交界部腺癌作为常见的消化道肿瘤，多种癌基因的突变和抑癌基因的失活可能对其发生、发展产生重要作用，但具体的分子机制尚不清楚［1］。TPX2（targeting protein for Xklp2靶蛋白）定位于人类染色体20q11．2，是一个受细胞周期严格调控的核增殖蛋白，在细胞有丝分裂纺锤体形成过程中发挥重要作用［2］。TPX2的异常表达与食管鳞癌、宫颈鳞癌等恶性肿瘤的关系密切，但对食管胃交界部腺癌影响的相关报道还较少。本研究通过免疫组织化学SP法和RT－PCR法检测食管胃交界部腺癌、癌旁不典型增生组织及正常胃黏膜组织中TPX2蛋白及TPX2mRNA的表达情况，探讨其在食管胃交界部上皮细胞癌变过程中的作用。

材料与方法

一、标本来源

收集2013年8月至2015年4月在南通市第一人民医院胸心血管外科治疗的80例食管胃交界部腺癌患者的标本。80例患者中，男性59例，女性21例；年龄42～77岁。术后病理：组织学分级Ⅰ级27例，Ⅱ级32例，Ⅲ级21例；浸润黏膜层14例，侵达肌层29例，侵达浆膜37例；伴淋巴结转移69例，无淋巴结转移11例；TNM分期，Ⅰ期9例，Ⅱ期33例，Ⅲ期38例。全部标本分别在无坏死区癌灶、癌旁3cm内（41例病理证实为上皮不典型增生）及远端正常胃黏膜取材。每例标本取材时均分为2份，一份取材后立即放置在液氮中冷冻，用于RT－PCR法检查TPX2mRNA的表达；另一份用4%甲醛固定，用于免疫组织化学法检测TPX2蛋白的表达。

二、SP法检测TPX2蛋白的表达

采用免疫组织化学SP法检测TPX2蛋白的表达。免疫组织化学试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司，TPX2兔抗人多克隆抗体购自Bioward公司。TPX2抗体稀释度为1︰500，DAB显色，苏木精复染，具体步骤按SP试剂盒说明书进行。用PBS代替一抗作阴性对照，用已知TPX2阳性的宫颈鳞癌组织切片作阳性对照。TPX2阳性细胞定位于细胞核，呈棕黄色颗粒。400倍显微镜下观察5个视野的阳性细胞数，评定标准以阳性细胞核占全部细胞核的百分比界定，核染色≤0表示“＋”，11%～30%表示“＋＋”，31%～50%表示“＋＋＋”，＞50%表示“＋＋＋＋”，其中核染色＞10%（＋＋以上）被判为阳性表达［3］。

三、RT－PCR法检查TPX2mRNA的表达

取100mg标本组织，采用TrizolTM（Invitrogen公司，美国）方法进行总RNA的提取，并按照试剂盒说明进行样品浓度和纯度的测定。收取的RNA溶于DEPC处理过的去离子水，—80℃冰箱保存。RT－PCR引物设计采用软件Oligio6．0，TPX2上游引物：5’－GCCCTTTGTTCCCAAGAAAGA－3’，下游引物：5’－AGCAGTGGAATCGAGTGGAGA－3’，扩增片段长度335bp。内参β－actin上游引物：5’－CATCCTGCGTCTGGACCT－3’，下游引物：5’－TCAGGAGGAGCAATGATCTTG－3’，扩增片段长度480bp。PCR反应体系：10mmol／L dNTPs混合物25μL，Taq DNA聚合酶（5IU／μL）0．5 μL，cDNA模板2μL，上、下游引物（10μmol／L）各0．5μL，DEPC水11μL，补水至25μL。PCR反应条件：95℃变性5min后，95℃30s，56℃30s，72℃1min，25个循环；最后，72℃延伸10min。RT－PCR产物经15g／L琼脂糖凝胶电泳分离［4］。

四、统计学处理

采用SPSS 11．0软件进行统计学分析，TPX2蛋白和mRNA表达的阳性率采用百分比表示，三种组织类型间的阳性率比较采用χ2检验。P＜0．05表示差异有统计学意义。

结 果

一、食管胃交界部腺癌、癌旁不典型增生组织及正常胃黏膜组织中TPX2蛋白和TPX2mRNA的表达

TPX2蛋白阳性信号位于细胞核内，呈棕黄色颗粒（图1）。正常胃黏膜、癌旁不典型增生组织及食管胃交界部腺癌组织中TPX2蛋白阳性率依次增高，三组间比较差异有统计学意义（χ2＝10．315，P＝0．018）。

RT－PCR扩增结果见图2，正常胃黏膜组织中TPX2mRNA呈低表达，食管胃交界部腺癌组织、癌旁不典型增生组织和正常胃黏膜组织中TPX2 mRNA的阳性率分别为77．5%（31／40）、69．4%（25／36）和7．1%（2／28），三组间比较差异有统计学意义（χ2＝7．468，P＝0．025）（表1）。二、TPX2蛋白和mRNA表达与食管胃交界部腺癌临床特点的关系

食管胃交界部腺癌组织中TPX2蛋白和mRNA表达的阳性率与癌组织浸润深度、淋巴结转移、肿瘤分期有关（P＜0．05），随着肿瘤浸润深度增加、淋巴结转移及肿瘤分期增高，TPX2表达的阳性率也逐渐增高（P＜0．05）；而在不同性别、年龄、组织分化程度患者中，TPX2表达的阳性率比较差异无统计学意义（P＞0．05）（表2）。

讨 论

食管胃交界部腺癌不仅发病率高，而且容易侵袭和转移，严重威胁人类的健康及生命［5］。近年来，随着外科手术、辅助放化疗等各项治疗技术的不断改进，食管胃交界部腺癌的诊断及治疗效果得到了明显地提高。但由于肿瘤的发生、发展是一个多阶段、多因素的复杂过程，导致食管胃交界部上皮细胞癌变的详细分子机制不明确，目前还没有特别有效的方法实现对食管胃交界部腺癌的早期诊断和有效治疗［6］。因此，寻找与食管胃交界部腺癌发生、发展密切相关的分子标志物或基因，可以为肿瘤的预防、早期诊断和有效治疗提供更加有效的方法。

图1 免疫组织化学法检测TPX2蛋白的表达 SP×400。A：正常胃黏膜组织；B：癌旁不典型增生组织；C：食管胃交界部腺癌组织。

图2 RT－PCR法检测TPX2mRNA的表达。M表示marker；A表示正常胃黏膜膜组织；B表示癌旁不典型增生组织；C表示食管胃交界部腺癌组织。

表1 TPX2蛋白和mRNA在不同类型组织中的表达

TPX2作为一种表达受细胞周期严格调控的基因，定位于人类染色体20q 11．2。在细胞周期的Gl－S交界期，TPX2开始出现，有丝分裂完成后消失。在S和G2期，TPX2分布在细胞核；而在有丝分裂期，TPX2通过与纺锤体的密切结合使动力蛋白XkIp2靶向结合到纺锤体微管，从而保证纺锤体的正常极性和姐妹染色单体的正确分离［7］。TPX2的异常表达能够抑制有丝分裂过程中正常核分裂的完成，干扰自身生理途径的激活，最终导致中心体扩增、异倍体形成，从而引起细胞的过度增殖，导致恶性肿瘤的形成［8］。同时，TPX2也可以通过影响细胞信号转导途经促进肿瘤细胞的分裂，增强肿瘤细胞的侵袭力。相关研究［9］认为 TPX2参与了STAT3和JAK1信号途径，上调JAK2、STAT1、钙黏蛋白E和CD44的表达，下调Cyclin D1的表达。因此，TPX2的异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关。既往的研究［10］显示，TPX2在肺腺癌、宫颈鳞癌等肿瘤中呈高表达。但在食管胃交界部腺癌中的表达及其与食管胃交界部腺癌侵袭转移关系的研究，国内外文献报道较少。明确TPX2在食管胃交界部腺癌组织中的表达及其对浸润转移的影响，可以为食管胃交界部腺癌的早期诊断和基因靶向治疗提供新的思路和理论依据。

表2 TPX2与食管胃交界部腺癌临床特点的关系

国内外很多学者采用免疫组织化学、RT－PCR、Western Blot等方法检测凋亡相关基因、细胞增殖相关基因、DNA损伤与修复相关基因以及信号转导相关基因等在多种肿瘤中的表达状态，通过观察癌基因与抑癌基因表达水平的改变来进一步探讨肿瘤细胞癌变的分子机制［11］。目前，已有学者采用RTPCR等方法对食管鳞癌组织中TPX2mRNA的表达进行了研究，结果提示TPX2与食管鳞癌的生物学行为关系密切，并可作为其预后评价的指标［12］。本研究显示：TPX2在正常胃黏膜上皮细胞中呈低表达，而在癌旁不典型增生组织及食管胃交界部腺癌组织中表达明显增高，提示TPX2的异常表达在食管胃交界部上皮细胞癌变过程中起到了重要的促进作用，是肿瘤发生的主要分子机制。肿瘤细胞的浸润和侵袭能力反映了肿瘤的恶性程度，也是造成其转移、扩散和影响预后的主要原因。本研究同时提示随着肿瘤浸润深度的增加、淋巴结的转移及肿瘤分期的增高，TPX2的表达也逐渐增高，这一结果与TPX2在宫颈鳞癌等组织中的表达基本一致，也进一步提示TPX2与肿瘤的侵袭转移关系密切，是肿瘤复发转移的危险因素，可以成为判断癌症预后的重要指标。当然，本研究目前仅通过蛋白及mRNA的检测来分析TPX2与食管胃交界部腺癌的关系，尚缺少分子水平、细胞水平的验证，需通过进一步研究来证实TPX2基因对食管胃交界部腺癌的影响。

综上所述，TPX2作为一种潜在的癌基因，通过参与细胞周期的调控来促进肿瘤细胞的增殖，影响肿瘤细胞的凋亡。TPX2的异常表达与食管胃交界部腺癌的发生、发展关系密切，可以成为食管胃交界部腺癌早期诊断及预后判断的新指标。

1 Zhi H，Zhang J，H u G，et al．The deregulation of arachidonic acid metabolism related genes in human esophageal squamous cell carcinoma［J］．Int J Cancer，2015，106（3）：327－331．

2 Ma Y，Lin D，Sun W，et al．Expression of targeting protein for xklp2associated with both malignant transformation of respiratory epithelium and progression of squamous cell lung cancer［J］．J Clin Cancer Res，2014，12（4）：1121－1127．

3 林冬梅，马莹，肖汀，等．TPX2在肺鳞状细胞癌及其癌前病变中的表达和意义［J］．中华病理学杂志，2006，35（9）：504．

4 刘红春，李莹莹，刘玉含，等．食管鳞癌组织中TPX2mRNA的表达及与临床病理生物学特征的关系［J］．临床与实验病理学杂志，2010，26（2）：708－710．

5 Tong T，Zhong Y，Kong J，et al．Over expression of Aurora A contributes to malignant development of human esophageal squamous cell carcinoma［J］．Clin Cancer Res，2014，10（21）：304－306．

6 Lin DM，Ma Y，Xiao T，et al．TPX2expression and its significance in esophageal squamous cell carcinoma［J］．Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi，2015，35（9）：540．

7 Shigeishi H，Ohta K，Hiraoka M，et al．Expression of TPX2in salivary gland carcinomas［J］．Oncol Rep，2009，21：341－344．

8 Warner SL，Stephens BJ，Nwokenkwo S，et al．Validation of TPX2as a potential therapeutic target in pancreatic cancer cells［J］．Clin Cancer Res，2015，15：6519－6528．

9 Vos JW，Pieuchot L，Evrard JL，et al．The Plant TPX2 protein regulates prospindle assembly before nuclear envelope breakdown［J］．Plant Cell，2008，20（10）：2783．

10 常海平，王敬芝，田原，等．宫颈鳞癌组织中TPX2的表达及其临床意义［J］．中国实用妇科与产科杂志，2012，28（9）：685－687．

11 Gritsko TM，Coppola D，Paciga JE，et al．Activation and over expression of centrosome kinase BT AK Aurora A in human ovarian cancer［J］．Clin Cancer Res，2003，9（4）：1420－1429．

12 Krams M，Heidebrecht HJ，Hero B，et al．Repp86expression and outcome in patients with esophageal squamous cell carcinoma［J］．J Clin Onco，2003，21（9）：1810．

Expression of TPX2 in esophageal gastric junction adenocarcinoma and its clinical significance

Shen Liang，Xu Yiming，Ding Shengguang，Zhong Chongjun．Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery，Nantong First People’s Hospital，Nantong 226001，China

Zhong Chongjun，Email：dllll423423＠163．com

Objective To investigate the expression of TPX2in esophageal gastric junction adenocarcinoma and its clinic significance．Methods Immunohistochemistry was used to detect the expression of TPX2protein in 80cases of esophageal gastric junction adenocarcinoma，41cases of adjacent atypical hyperplasia tissues and 48cases of normal gastric mucosa tissues．RT－PCR was adopted to determine the expression of TPX2mRNA in 40cases of esophageal gastric junction adenocarcinoma，36cases of adjacent atypical hyperplasia tissues and 28cases of normal gastric mucosa tissues． ResultsThe positive rates of TPX2protein expression in esophageal gastric junction adenocarcinoma，adjacent atypical hyperplasia tissues and normal gastric mucosa tissues were 71．2%（57／80），53．7%（22／41）and 31．2%（15／48），respectively，and there were significant differences among them（χ2＝10．315，P＝0．018）．The positive rates of TPX2mRNA expression were 77．5%（31／40），69．4%（25／36）and 7．1%（2／28），respectively，and there were significant differences among them（χ2＝7．468，P＝0．025）．The positive rates of expression of TPX2protein and mRNA in esophageal gastric junction adenocarcinoma increased with the infiltration depth，lymph node metastasis and tumor staging（P＜0．05），while were not related to sex，age and tissue differentiation（P＞0．05）．Conclusions The abnormal expression of TPX2may be involved in early carcinogenesis，infiltration and metastasis of esophageal gastric junction adenocarcinoma，and the detection of TPX2expression may play an important role in the early diagnosis and prognosis prediction in patients with esophageal gastric junction adenocarcinoma．

TPX2； Esophageal gastric junction adenocarcinoma； RT－PCR； Immunohistochemistry

2015－08－20）

（本文编辑：周珠凤）

10．3877／cma．j．issn．2095－8773．2015．04．005

南通市卫生局青年科研基金（WQ2014021）

226001 南通市第一人民医院胸心血管外科

仲崇俊，Email：dllll423423＠163．com

沈亮，许一鸣，丁胜光，等．TPX2在食管胃交界部腺癌中的表达及临床意义［J／CD］．中华胸部外科电子杂志，2015，2（4）：232－236．