蚯蚓粪中异养脱硫菌筛选及效果测定

周东兴，徐明明，迟婷婷，王维晨，王兵，刘佳斌，宁玉翠

（东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨150030）

蚯蚓粪中异养脱硫菌筛选及效果测定

周东兴，徐明明，迟婷婷，王维晨，王兵，刘佳斌，宁玉翠

（东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨150030）

利用初筛和复筛结合方法从蚯蚓粪中筛选出六株高效异养脱硫菌种S2、S3、S5、S6、S7、S10。经硫化氢降解率测试结果表明，培养25 d，与CK相比H2S释放量分别降低44.50%、53.48%、37.99%、16.41%、30.67%、41.14%。将不同菌株复配，其中S2+S3+S5、S2+S3+S7菌种组合H2S释放量最低，较对照降低71.53%、65.01%。表明脱硫菌有效降低H2S释放量，三个菌株复合除臭效果好于单个菌株，可为生物脱硫法研究提供理论依据。

蚯蚓粪；硫化氢；生物除臭

恶臭是当今世界七种典型公害（大气污染、水质污染、土壤污染、噪声污染、振动、地面下沉、恶臭）之一[1]，已引起广泛关注。其中硫化氢是典型的恶臭气体代表。硫化氢是强烈的神经毒物，对粘膜有强烈刺激作用，高浓度时可直接抑制呼吸中枢引起迅速窒息致死[2-5]。

生物脱硫法具有处理效率高、可降解复杂成分的恶臭气体、无二次污染等优点[6-7]。在水、微生物和氧存在条件下，利用微生物代谢作用氧化分解发臭物质，达到净化气体目的[8-9]。生物除臭法在微生物作用下进行，高效除臭微生物分离与筛选有助于生物除臭技术发展。Maestre等研究已发现多株自养型和异养型脱硫菌，自养脱硫菌中的硫杆菌属、无色硫细菌和光合细菌等应用较为常见[10-12]；异养脱硫菌则种类繁多。梁美生等对各菌种脱硫能力测定结果表明，异养菌生长速度快、周期短，对于含量较低的硫化物降解效果较好；自养菌生长周期长，脱硫作用缓慢，去除效率低。短时间内异养菌脱硫能力高于自养菌，适合大量培养[13]。蚯蚓粪因其天然的疏松多孔结构具有吸附臭气作用。王树乾等研究表明，蚯蚓粪中含有大量微生物，能够通过自身代谢作用将恶臭物质生物降解[14]。近年来，我国对蚯蚓粪的农业利用研究较多，而蚯蚓粪中除臭微生物的筛选鲜见报道[15]。本试验利用蚯蚓粪除臭特性，筛选高效脱硫菌株，将得到菌种复配，对复合菌株对硫化氢的降解能力进行测试，在去除恶臭污染同时，实现“以废治废”的目的，为生物脱硫法研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌种来源

用于分离筛选菌种的试验材料为蚯蚓处理城市污泥得到的蚯蚓粪。

1.2 培养基

脱硫菌选择培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏2 g，NaCl 5 g，Na2S 2 g，蒸馏水1 L，pH 6.5～7.5。加入琼脂溶化后制成固体培养基[13]。本试验所用培养基均在上海博讯实业有限公司医疗设备厂生产的立式压力蒸汽灭菌器中完成灭菌。

1.3 菌种富集驯化

取10 g新鲜蚯蚓粪于100 mL三角瓶中，放入直径2 mm玻璃珠5颗，用于分散细胞，加入90 mL无菌水，震荡30 min制成菌悬液。将10 mL菌悬液加入100 mL液体选择培养基中，30℃、120 r·min-1培养5 d后，移取10 mL到新的100 mL选择培养基培养5 d，如此每隔5 d转到新的培养基，连续驯化30 d，得到富集菌液。

1.4 分离纯化

取1 mL富集菌液作梯度稀释，将10-4、10-5、10-6菌液0.1 mL分别接种到脱硫菌固体选择培养基平板上，每个梯度3次重复，于30℃倒置培养5 d。选取单个菌落反复划线纯化，直至显微镜下观察无杂菌得到纯菌株。将所有分离得到的菌种接入液体选择培养基中，30℃、120 r·min-1培养3 d制成菌液[16]。

1.5 菌种筛选

初筛：将5 mL菌液接入装有50 g新鲜鸡粪的1 000 mL广口瓶中，同时接种5 mL无菌水作为对照，双层塑料膜密封。置于30℃培养箱中培养，每隔3、5、8、11、15 d用感官法初步判定菌株除臭效果，将除臭能力明显的菌株进行复筛试验[17]。

复筛：将50 g新鲜鸡粪加入1 000 mL广口瓶中，接种5 mL纯化得到菌液，每个菌种3次重复，同时接种5 mL无菌水作为对照。在每个广口瓶中放一个盛有20 mL碱性锌氨络盐吸收液的50 mL小烧杯（用于吸收H2S气体）。广口瓶盖盖后用双层塑料膜密封。置于30℃培养箱中培养，每隔3、5、8、11、15、20、25 d检测H2S释放量。选出H2S释放量较少的菌种用于后续研究。

1.6 脱硫性能分析方法

H2S检测：碱性锌氨络盐吸收——亚甲基蓝比色法[18]；

SO42-测定：铬酸钡分光光度法[19]。

1.7 菌种拮抗试验

将复筛得到的菌种两两交叉划线，30℃培养3 d，观察交叉处菌落生长情况，是否有拮抗现象。

1.8 菌种鉴定

利用光学显微镜鉴定菌落形态，根据文献[20-21]进行生理生化鉴定。

2 结果与分析

2.1 初筛结果

表1表明，分离筛选出的菌株除臭效果有所不同，与对照相比，基本上均具有除臭作用，14株菌株中S2、S3、S5、S6、S7、S10具有较好除臭效果。

2.2 复筛结果

将初筛得到的菌种复筛，结果见图1。

H2S释放量在前11 d一直呈现上升趋势，第11天时达到最高峰，之后呈现下降趋势，第25天接种S2、S3、S10、S7处理中硫化氢释放量已比较低。H2S释放量从高到低依次为CK、S6、S7、S5、S10、S2、S3，与CK相比H2S释放量分别降低16.40%、30.67%、37.99%、41.14%、44.50%、53.48%。

复筛试验验证前初筛试验结果可靠性，同时也说明感官评价局限性，因为菌种S10在初筛试验中表现出与菌种S3同样除臭效果，而化学检测H2S含量却相对较高，未能达到理想效果。推测原因是臭气成分较复杂，感官评价结果不精确。

2.3 脱硫产物测定

对复筛菌种菌液进行脱硫产物测定，结果如图2所示。

相关研究表明，还原态无机硫在培养液中的微生物作用，氧化最终生成硫酸根离子[22]，因此脱硫液中硫酸根离子增量也能间接反映脱硫菌脱硫效率。经20 h培养，脱硫液中SO42-离子产生量从低到高依次为CK、S6、S7、S10、S5、S2、S3，与脱硫菌脱硫效率基本一致，由此可见，脱硫菌作用下S2-主要被氧化成SO42-。

表1 菌种初筛试验结果(接种15 d)Table 1Result of preliminary screening of strains(Inoculant 15 d)

图1 不同菌株对H2S释放的影响Fig.1Effect of different strains on H2S emission

图2 不同菌液中SO42-含量Fig.2Effect of SO42-incremental concentration in nutrient solution for different strain

2.4 菌种拮抗试验

将复筛得到菌种进行交叉划线试验，结果表明，各菌种在交叉处生长良好，均无拮抗现象。

2.5 不同菌株复配对H2S释放量影响

将互不拮抗的菌株复配，结果如图3所示。

图3 不同菌株复配对H2S释放量影响Fig.3Effect of complex formulation of different strains on H2S emission

组合1、4、2复配去除H2S效果较好，总释放量较对照分别降低71.53%、65.01%、53.01%。组合6菌种复配虽然使H2S降解率达到49.73%，但最后H2S释放量仍然相对较高，组合3、组合5虽彼此无拮抗作用，但菌种复配效果不佳。

2.6 菌株鉴定

由表2可知，菌株初鉴定，S2为芽孢杆菌属，S3为黄单胞菌属，S5为假单胞菌属。

表2 菌株形态及生理生化鉴定Table 2Individual colony and physiological and chemical characteristics of strains

3 讨论

蚯蚓粪具有高孔隙度和比表面积，是臭气高效吸附剂，蚯蚓粪中含大量微生物，对臭气物质具有良好吸收净化功能[23]。早在1978年日本研制蚯蚓粪粒除臭小型装置，经污水厂实际应用证实蚯蚓粪粒除臭作用，并命名为“蚯蚓粪粒除臭剂”[24]。韩立军等研究报道，蚯蚓粪中所含微生物可促进臭气中NH3、H2S分解，随蚯蚓粪添加量增加去除效果提高[25]。用蚯蚓粪作为垫料，可有效改善肉鸡舍环境条件，使肉鸡舍内NH3、H2S含量明显降低[26]。尚丽勤将筛选出的互补拮抗除臭微生物进行菌种复配，脱硫复合菌株使得H2S平均释放量与CK相比释放量降低46.26%[27]。

本研究从蚯蚓粪中筛选出具有脱硫效果异养除臭菌。将筛选菌种复配，使H2S降解率比对照降低71.53%。与其他除臭微生物研究相比，在材料选择方面，蚯蚓粪具有原料丰富、成本低的优点；在菌株筛选方面，异养脱硫菌与自养脱硫菌相比具有生长周期短、繁殖快、效率高等优点，更适用于H2S微生物降解；在脱硫效果方面，三株脱硫菌组成的复合菌株脱硫效果均高于单菌株，使H2S降解率达到71.53%。

4 结论

a.筛选得到六株脱硫效果较好的菌种S3、S2、S10、S5、S7、S6，使H2S释放量与CK相比分别降低53.48%、44.50%、41.14%、37.99%、30.67%、16.41%。

b.S2、S3与S5组合效果最好，与对照相比H2S降解率达到71.53%。

c.经初步鉴定S2为芽孢杆菌属，S3为黄单胞菌属，S5为假单胞菌属。

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Screening and effect testing of heterotrophic degrading hydrogensulfide bacteria of earthworm cast/

ZHOU Dongxing,XU Mingming,CHI Tingting, WANG Weichen,WANG Bing,LIU Jiabin,NING Yucui
(School of Resources and Environmental Sciences,NortheastAgricultural University,Harbin 150030,China)

Six strains of high-efficiency heterotrophic degrading hydrogen sulfide bacteria S2,S3,S5, S6,S7,S10 were isolated by combing preliminary screening and secondary screening from earthworm cast. The results showed that hydrogen sulfide degradation rate testing indicated:they could decrease H2S emission by 44.50%,53.48%,37.99%,16.41%,30.67%and 41.14%compared with the control group in 25 days.Composited strains of S2+S3+S5 and S2+S3+S7 performed a good effect,decreased H2S emission by 71.53%and 65.01%.It showed that degrading hydrogen sulfide strains could decrease H2S emission effectively,the desulfurization of three strains complex formulation was better than single strain of degrading hydrogen sulfide.The results above provided reference for biological deodorization researching.

earthworm cast;hydrogen sulfide;biological deodorization

S767.5

A

1005-9369（2015）09-0059-05

时间2015-9-23 9：38：08[URL]http：//www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150923.0938.006.html

周东兴,徐明明,迟婷婷,等.蚯蚓粪中异养脱硫菌筛选及效果测定[J].东北农业大学学报,2015,46(9):59-63.

Zhou Dongxing,Xu Mingming,Chi Tingting,et al.Screening and effect testing of heterotrophic degrading hydrogen sulfide bacteria of earthworm cast[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(9):59-63.(in Chinese with English abstract)

2014-10-17

科技部科技成果转化项目（2013GB2B200134）；黑龙江省重大攻关项目（GA11B501）

周东兴（1972-），男，教授，博士，博士生导师，研究方向为废弃物资源化利用。E-mail：zhboshi@163.com