构建高效去除五氯酚的生物阴极

刘 鼎，李中坚，雷乐成

（浙江大学 生物质化工教育部重点实验室，浙江 杭州310027）

生物阴极是指微生物电化学系统中，附着有生物膜并能将电子传递给微生物进行一系列生物电化学反应的电极［1］.由于其在污水处理［2］、生物合成［3］以及生物固碳［4］等领域均有着潜在的应用价值，受到了越来越多学者的关注.

在生物阴极研究中，用于接种的污泥一般取自生活污水处理厂或污染源现场水样［5］.为了使微生物电化学系统达到较高的运行效果，需要对接种的细菌进行一系列的筛选与驯化［6-8］.目前，大多数学者利用微生物燃料电池或微生物三电极体系对菌种进行筛选及驯化，通过给工作电极施加负电势，促进电化学活性细菌（electrochemically active bacteria，EAB）在电极表面大量富集［9-11］.然而，在筛选与驯化用于高效去除难降解有机污染物的EAB时，污染物对细菌具有毒性，会抑制细菌的新陈代谢活动，从而影响电化学筛选与驯化效果.

本文对原始污泥依次进行污染物定向富集、亲氢气自养菌梯度筛选微生物三电极体系驯化，建立一套适用于难降解有机污染物处理的生物阴极构建方法.在此基础上，分析五氯酚（pentachlorophenol，PCP）的初始质量浓度、氧化还原介体以及pH 值对生物阴极运行性能的影响.

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验中所用血清瓶（125 mL）、顶空铝盖（直径20mm）、封口器等购于杭州米克化工有限公司.丁基胶塞购于美国Chemglass 公司，型号为CLS-4209-14.工作电极为高纯石墨块电极（5cm×3cm×1cm，纯度为99.99%，北京吉兴盛安工贸有限公司）.对电极为直径0.6cm，长20cm 的高纯石墨棒（纯度为99.99%，北京吉兴盛安工贸有限公司）.参比电极为上海精密科学仪器有限公司232-01型饱和甘汞电极（相对标准氢电极电势为＋240 mV，本文所有电势均指相对标准氢电极电势）.实验中使用的质子交换膜为NafionTM117 质子交换膜（美国Dupont公司）.

1.2 反应装置

实验所使用的反应器为双室反应器，由2个对称的玻璃反应器组成，每个反应器的有效容积为340mL.反应器外层由玻璃夹套包裹，实验过程中，循环泵入恒温蒸馏水，以保证反应器内营养液温度恒定.工作电极室与对电极室相连处通过质子交换膜阻隔，其横截面积为15.9cm2.质子交换膜在使用前参照Liu等［12］的报道进行预处理.

1.3 实验试剂及营养液组成

亲氢气自养菌筛选及EAB 驯化过程采用厌氧基础培养液，其组成如表1所示.其中，对电极室内的厌氧基础培养液不添加微量金属元素溶液和维生素溶液.

表1 每升厌氧基础培养液的组成（pH＝7.0）Tab.1 Components of anaerobic basal medium per liter（pH＝7.0）

1.4 亲氢气自养菌筛选方法

用于筛选亲氢气自养菌的菌种来自实验室厌氧／好氧生物流化床中的厌氧室，该反应器内污泥取自杭州市四堡污水处理厂厌氧工艺段，具体筛选步骤如下.

1）将28mL 厌氧基础培养液分装至3 组平行的血清瓶中，并分别投加0.04 mg PCP，取2 mL PCP降解菌富集菌液加入到血清瓶中，盖紧胶塞后用顶空铝盖加以密封.

2）通入N2／CO2混合气（体积比为80∶20）30min.之后，充入高纯氢气，使瓶内氢气分压达到0.2 MPa.

3）每隔12h，取0.5mL样品，测试PCP的质量浓度ρPCP.当PCP被完全降解时，取出10 mL 血清瓶中营养液，并添加10mL新配制的营养液.

4）更替营养液时，采用梯度投加的方式逐级递增PCP的投加量.

1.5 电化学活性细菌的驯化

EAB的驯化在微生物三电极体系中进行.接种前，先取335mL含有PCP的厌氧基础培养液添加到反应器的工作电极室中，通入N2／CO2混合气30min.之后，将用于去除PCP 的亲氢气自养菌进行稀释，使OD600值（微生物悬浊液在600nm 处的吸光度，用以衡量微生物浓度的常规指标）达到0.6.取5mL稀释后的菌液加入到反应器中.

采用计时电流法（chronoamperometry，CA）对EAB进行驯化，电极电势控制在-0.2V，每隔10min记录一次电流值.每隔12h对反应器内的PCP质量浓度进行测定，之后对PCP质量浓度进行调节，使其维持在20mg／L的水平.当工作电极的电流达到稳定时，将电极表面的生物膜刮入离心管中，并利用厌氧基础培养液定容到5mL，重新启动挂膜.所有反应器均以铝箔包裹.实验过程中，持续向反应器中通入N2／CO2混合气，控制温度在30℃.驯化结束后，对电极进行循环伏安（cyclic voltammetry，CV）扫描，扫描电势范围为-0.56～1.04V，扫描速率为5mV／s.

为比较筛选方法的效果，分别取厌氧／好氧生物流化床厌氧室内污泥以及经LB液体培养基富集培养后的菌液进行接种，作为对照实验.

1.6 分析方法

采集的样品先经过高速离心（10 000r／min）处理，通过0.22μm 滤膜对离心处理后的上清液进行过滤，取滤液进行分析.

PCP 质量浓度利用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）进 行 测定.氯离子浓度利用离子色谱（ion chromatography，IC，Dionex ICS-1100）进行分析.总有机碳（total organic carbon，TOC）利 用 总 有 机 碳 分 析 仪（Shimadzu TOC-VCPH）直接测定.

库仑效率（coulombic efficiency，CE）在本研究中是指参与还原PCP 的电荷数与外电路传递的电荷数的比值，计算公式为

式中：VC为工作电极室的有效容积（340mL）；F 为法 拉 第 常 数（Faraday's constant，96485 C／mol e-）；b表示每脱去一个氯原子所需要的电子数（1 mol e-／mol Cl-）；△ρCl表示实验前后Cl-质量浓度的增加量；M 为Cl-的相对质量（35.5g／mol）；Q 为总电量，即电流对运行时间的积分.

2 结果与讨论

2.1 亲氢气自养菌的筛选

难降解有机污染物对微生物往往具有一定的毒害作用，因此在筛选亲氢气自养菌的过程中，采用污染物梯度投加的方式，即在确保其它条件不变的情况下，开始先投加低浓度的PCP，待微生物适应这一浓度范围后再逐步提高PCP的投加量.

如图1所示为高效去除PCP 的亲氢气自养菌筛选过程.经过17个周期的连续筛选，菌液对PCP的去除速率由开始时的0.30±0.02mg／（L·d）上升到2.12±0.05mg／（L·d），亲氢气自养菌在血清瓶内不断富集.从筛选过程来看，PCP 对微生物具有一定的毒性，当PCP初始质量浓度由7mg／L 上升到14mg／L时，去除速率迅速从1.90±0.07mg／（L·d）下降至0.11±0.03 mg／（L·d），经过7天的培养后，其去除速率才逐渐恢复到1.86±0.13 mg／（L·d）.实验结果说明：经过一段时间的定向筛选，亲氢气自养菌得到了富集，并可在有机碳源匮乏的环境中利用氢气作为电子和能量来源驱动细胞内一系列的代谢过程.尽管经过筛选后的菌种对PCP具有较强的去除效果，PCP对微生物仍旧具有一定的毒害作用.通过连续的筛选，具有高效降解PCP酶系的微生物得以在体系中保留，并将这一性状传递给子代细菌，从而表现为血清瓶内的菌种逐渐适应高浓度的PCP溶液，并且PCP去除速率不断提升.

图1 高效去除五氯酚的亲氢气自养菌筛选过程Fig.1 Procedure of hydrogenophilic autotrophic bacteria screening for efficient removal of PCP

2.2 电化学活性细菌的驯化

如图2所示为高效去除PCP的EAB的驯化过程.微生物的生长经过了适应期、增长期和稳定期3个阶段.随着驯化周期的推进，EAB的适应期从9d减少到了3d，稳定期电流密度J 从-25mA／m2左右增长到-31mA／m2左右.图中，反应器电流密度在第3个驯化周期的后期出现了明显的波动.这主要是由于在驯化过程进行到后期时，对N2／CO2混合气进行了更换.在这一过程中，由于进气量发生了波动，从而导致体系中电流密度发生明显的波动.此外，电流密度的波动也有可能是由于触碰到了电化学工作站连接线.由于石墨棒电极相对较粗，轻微的触碰可能导致鳄鱼夹与电极间接触电阻发生变化，导致电流密度的突然波动.

图2 高效去除五氯酚的电化学活性细菌驯化过程中电流密度的变化Fig.2 Change of current densities during acclimation of electrochemically active bacteria for efficient removal of PCP

通过对CV 图谱（见图3）的分析可以发现，与驯化开始前以及未接种细菌的对照实验相比，在经过驯化后的生物阴极CV 图的0.3V 处出现了一个明显的氧化还原峰.这说明EAB的存在使得电极具有对PCP的还原能力.值得注意的是，在-400mV电势下生物阴极的电流量低于驯化前和非生物阴极驯化后的电流量，造成这一现象的原因可能是：1）石墨块电极板与石墨棒接触处通过碳导电胶相粘，因此不同电极间的电阻值有一定的差异.2）生物阴极表面覆盖有一层EAB，减少了电极与电解液的接触面积，因此在生物阴极上，质子的电化学还原速率相较于非生物阴极要慢.3）尽管EAB可催化电化学产氢反应，但是循环伏安扫描时间较短（在负电势条件下共持续23s），微生物没有足够的时间适应电势条件的改变，因此生物阴极对电化学产氢的促进作用不明显.

为了比较本研究中EAB 的筛选与驯化方法与传统方法的差异，特设立了2组平行实验进行对照.如图2所示，以厌氧／好氧生物流化床内厌氧室内的污泥以及LB 液体培养基富集菌液作为接种源，分别代表三电极体系直接驯化及先筛选后电化学驯化的方法.经过前期含有PCP的LB培养基富集培养后，接种液中的细菌比厌氧／好氧生物流化床内厌氧室的细菌对高浓度PCP溶液具有更好的适应性，其电流密度的上升速度为后者的2.0～3.0倍.然而，其挂膜所需的时间远超过本实验的筛选方法（接种14d后仍然未达到稳定状态），其最终的电流密度仅为本实验筛选方法的1／7.

图3 用于处理五氯酚的电化学活性细菌驯化不同阶段的循环伏安图谱Fig.3 Cyclic voltammograms at different stages of electrochemically active bacteria acclimation

在电化学驯化之前引入亲氢气自养菌的筛选过程，能够有效地从PCP高效降解菌中筛选出潜在的以电极作为电子供体的菌种.因此，当把经过筛选后的亲氢气自养菌接种到反应器后，菌种能够较快速地适应电化学驯化体系.另外，前期的筛选排除了电化学驯化过程中杂菌对EAB 的干扰，为EAB 在电极表面的附着提供了更多的空间，大幅缩短了电化学驯化所需要的时间，提高了生物阴极的性能.

2.3 五氯酚的初始浓度对生物阴极去除五氯酚的影响

当电极电势为-400 mV 时，生物阴极对PCP的去除能达到较高水平，且此时的能量利用效率最高［13］.当电极电势在-400mV 以下时，电极表面会发生产氢反应，库仑效率大幅下降［14-16］.这一副反应降低了生物阴极的能量利用效率，不利于工程上的实际应用.因此，所有实验都在电极电势小于-400mV的条件下进行.

通过对PCP初始质量浓度ρ0（PCP）的分析可以发现，生物阴极对PCP的去除率（RPCP＝△ρ／ρ0（PCP））以及脱氯速率（RCl＝△ρCl／△t）随着PCP 初始质量浓度的升高（由10mg／L上升到20 mg／L）而增加.但是，当PCP初始质量浓度进一步由20mg／L上升到40mg／L时，生物阴极对PCP的去除能力迅速下降（见图4）.这是由于高浓度的PCP溶液对EAB具有一定的毒性，而电化学还原作用对PCP的去除效果有限，继续增加PCP 的初始浓度，会使得其在溶液中大量富集.

与非生物阴极相比，生物阴极具有对PCP更强的去除能力，当ρ0（PCP）＝20mg／L时，生物阴极对PCP的去除率为非生物阴极的3 倍，对TOC 的去除率（RTOC＝△T／T0）为非生物阴极的2.7倍，脱氯速率为非生物阴极的5.4倍.由此可见，生物阴极上的EAB能够利用电极作为电子供体，催化PCP 的高效降解.值得注意的是，相较于非生物阴极，利用生物阴极处理PCP 时，电极具有更高的库仑效率.这说明，生物阴极可以催化电子由电极向PCP的定向转移，从而加速对PCP的还原脱氯.然而，生物阴极对于PCP脱氯产物的矿化效果一般，在所有经过还原后的PCP 脱氯产物中，只有20%左右的中间产物被完全矿化.EAB 对PCP 的矿化不再属于生物电化学反应，其反应速率受限于微生物体内一系列的酶促反应，因此，TOC 去除率与五氯酚去除率及库仑效率之间存在一定的差异.

2.4 氧化还原介体对生物阴极去除五氯酚的影响

如图5 所示为不同蒽醌-2，6-磺酸钠（anthraquinone-2，6-disulfonate，AQDS）浓度（cAQDS）下，生物阴极及非生物阴极中的PCP 去除率、脱氯速率、TOC去除率以及库仑效率.在非生物阴极反应器中，AQDS对PCP 的去除率没有任何影响，说明AQDS不能直接将电子转移给PCP.当AQDS浓度增加时，非生物阴极中库仑效率随之下降，这说明AQDS与PCP在电极表面存在着竞争电子的关系.在生物阴极中，尽管库仑效率随着AQDS浓度的增加而下降，但是其对PCP和TOC的去除率均有一定的提升.

图4 五氯酚初始浓度对生物阴极性能的影响Fig.4 Effects of initial PCP concentration on the performance of biocathode

图5 蒽醌-2，6-磺酸钠浓度对生物阴极性能的影响Fig.5 Effects of AQDS concentration on the performance of biocathode

对反应器运行前后溶液中的生物量进行测试，当添加0.01 mM 的AQDS 时反应器中残余液的OD600值（0.147）较未添加AQDS时反应器中残余液的OD600值（0.025）有了显著提升.由于AQDS可作为氧化还原电子介体，当将其添加进反应器后，一部分利用外源电子介体作为电子供体的EAB 不再需要附着在电极上与其它细菌竞争空间，而是在溶液中悬浮生长，并可通过AQDS的介导，间接地利用外电路电子进行一系列的代谢及PCP 降解反应.

2.5 pH 值对生物阴极去除五氯酚的影响

PCP的还原脱氯除了需要外源电子供体，还需要有质子的参与，其反应式如下：

因此，pH 值对于生物阴极中PCP 的去除率具有一定的影响.如图6所示，当pH 值由8.0下降至5.5时，非生物阴极对PCP的去除效果不断增强，即较低的pH 值有利于PCP的电化学还原.在生物阴极中，当pH 值由8.0下降到6.5时，PCP去除率逐渐增高，在pH＝6.5的条件下，生物阴极对PCP的去除效果达到最佳（89.66±3.66%）.然而，继续降低pH 值，生物阴极对PCP 的去除率却迅速下降，说明当pH 值低于6.0时会对电化学活性细菌产生抑制作用.这一结果与传统生化处理方法中PCP降解菌最适的pH 范围（6.0～7.0）一致［17］.

图6 pH 值对生物阴极性能的影响Fig.6 Effects of pH on performance of biocathode

3 结 论

（1）本研究建立了一套用于筛选与驯化处理难降解有机污染物的EAB方法，大幅缩短了生物阴极的挂膜时间，并有利于提高生物阴极的运行性能.与传统的直接电化学筛选与驯化方法相比，该方法将生物阴极构建时间由超过14d缩短到3d，且电流密度较传统方法提高了6倍.

（2）生物阴极可以有效去除PCP，最适的PCP初始质量浓度为20mg／L，当初始质量浓度达到30 mg／L及以上时，会对微生物产生毒害作用.AQDS能促进EAB 的悬浮生长，间接参与PCP 的降解.pH 值越低越有利于PCP 的还原脱氯，但较低的pH 值会抑制EAB的活性，最适pH 值为6.5.当电极电势为-400 mV，PCP 初始质量浓度为20 mg／L，pH 值为6.5，且无氧化还原介体时，反应器运行100h后的PCP去除率为89.66±3.66%，TOC 去除率为17.24±3.03%.

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）：

［1］HE Z，ANGENENT L T.Application of bacterial bio-cathodes in microbial fuel cells ［J］.Electroanalysis，2006，18（19-20）：2009-2015.

［2］ZHANG G D，ZHAO Q L，JIAO Y，et al.Biocathode microbial fuel cell for efficient electricity recovery from dairy manure［J］.Biosensors and Bioelectronics，2012，31（1）：537-543.

［3］CHENG S A，XING D F，CALL D F，et al.Direct biological conversion of electrical current into methane by electromethanogenesis［J］.Environmental Science and Technology，2009，43（10）：3953-3958.

［4］NEVIN K P，HENSLEY S A，FRANKS A E，et al.Electrosynthesis of organic compounds from carbon dioxide is catalyzed by a diversity of acetogenic microorganisms［J］.Applied and Environmental Microbiology，2011，77（9）：2882-2886.

［5］HOU B，SUN J，HU Y Y.Effect of enrichment procedures on performance and microbial diversity of microbial fuel cell for Congo red decolorization and electricity generation［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2011，90（4）：1563-1572.

［6］RINGEISEN B R，RAY R，LITTLE B.A miniature microbial fuel cell operating with an aerobic anode chamber［J］.Journal of Power Sources，2007，165（2）：591-597.

［7］JEREMIASSE A W，HAMELERS H V M，CROESE E，et al.Acetate enhances startup of a H2-producing microbial biocathode［J］.Biotechnology and Bioengineering，2012，109（3）：657-664.

［8］RINGEISEN B R，HENDERSON E，WU P K，et al.High power density from a miniature microbial fuel cell using Shewanella oneidensis DSP10［J］.Environmental Science and Technology，2006，40（8）：2629-2634.

［9］HUANG L P，CHAI X L，CHEN G H，et al.Effect of set potential on hexavalent chromium reduction and electricity generation from biocathode microbial fuel cells［J］.Environmental Science and Technology，2011，45（11）：5025-5031.

［10］CLAUWAERT P，RABAEY K，AELTERMAN P.Biological denitrification in microbial fuel cells［J］.Environmental Science and Technology，2009，41 （9）：3354-3360.

［11］WANG A J，CHENG H Y，LIANG B，et al.Efficient reduction of nitrobenzene to aniline with a biocatalyzed cathode［J］.Environmental Science and Technology，2011，45（23）：10186-10193.

［12］LIU H，LOGAN B E.Electricity generation using an air-cathode single chamber microbial fuel cell in the presence and absence of a proton exchange membrane［J］.Environmental Science and Technology，2004，38（14）：4040-4046.

［13］LIU D，LEI L C，YANG B，et al.Direct electron transfer from electrode to electrochemically active bacteria in a bioelectrochemical dechlorination system ［J］.Bioresource Technology，2013，148：6-9.

［14］VILLANO M，DE BONIS L，ROSSETTI S，et al.Bioelectrochemical hydrogen production with hydrogenophilic dechlorinating bacteria as electrocatalytic agents［J］.Bioresource Technology，2011，102（3）：3193-3199.

［15］AULENTA F，CANOSA A，MAJONE M，et al.Trichloroethene dechlorination and H（2）evolution are alternative biological pathways of electric charge utilization by a dechlorinating culture in a bioelectrochemical system ［J］.Environmental Science and Technology，2008，42（16）：6185-6190.

［16］JEREMIASSE A W，HAMELERS E V M，BUISMAN C J N.Microbial electrolysis cell with a microbial biocathode［J］.Bioelectrochemistry，2010，78（1）：39-43.

［17］MUN C H，HE J Z，NG W J.Pentachlorophenol dechlorination by an acidogenic sludge［J］.Water Research，2008，42（14）：3789-3798.