雷帕霉素增强卵巢癌细胞系对顺铂敏感性的机制研究△

张永清 徐春玉 李锐锐 卢静 焦坤 黄杰 周童亮 苗劲蔚#

1首都医科大学附属北京妇产医院妇瘤科，北京100026 2首都医科大学基础医学院动物实验室，北京100069

3美国俄亥俄州立大学基础医学院实验室，哥伦布200060 4中日友好医院基础实验室，北京100029

雷帕霉素增强卵巢癌细胞系对顺铂敏感性的机制研究△

张永清1徐春玉1李锐锐1卢静2焦坤2黄杰3周童亮4苗劲蔚1#

1首都医科大学附属北京妇产医院妇瘤科，北京1000262首都医科大学基础医学院动物实验室，北京100069

3美国俄亥俄州立大学基础医学院实验室，哥伦布2000604中日友好医院基础实验室，北京100029

目的研究雷帕霉素对卵巢癌细胞系顺铂敏感性的影响，以及PI3K/AKT/m TOR信号通路（简称m TOR信号通路）与卵巢癌细胞系顺铂耐药的相关性；初探雷帕霉素增强卵巢癌细胞系顺铂敏感性的分子机制。方法采用CCK-8法检测卵巢癌顺铂耐药细胞系SKOV3/DDP的耐药指数（resistance index，RI）、细胞增殖抑制率；采用克隆平板实验观察不同用药方案对卵巢癌顺铂非耐药细胞系及SKOV3细胞系两种细胞系克隆形成的影响；采用蛋白质印迹法（Western blot）检测两种细胞系的蛋白表达差异。结果①SKOV3/DDP细胞系的RI为6.10，属中度耐药。②在SKOV3细胞系中，顺铂联合雷帕霉素作用24 h、48 h后的细胞增殖抑制率明显高于单用顺铂组，差异有统计学意义（P＜0.01），两组间的72 h细胞增殖抑制率无明显的统计学意义（P＞0.05）；顺铂联合雷帕霉素作用于SKOV3/DDP细胞系24 h、48 h、72 h后的细胞增殖抑制率均明显高于单用顺铂组，差异有统计学意义（P＜0.01）。③雷帕霉素联合顺铂作用于SKOV3细胞系4 h后，其克隆形成抑制率明显高于单用顺铂组，差异有统计学意义（P＜0.01）。④SKOV3/DDP细胞系比SKOV3细胞系p-mTOR、p-AKT的表达升高，而m TOR、AKT的表达则相似。⑤联合用药组比单用顺铂组的PARP断裂增加。⑥雷帕霉素作用SKOV 3细胞系24 h，BCL2表达下调，LC3B由LC3BⅠ向LC3BⅡ转化增加；在SKOV3/DDP细胞系中未发现这两种作用。结论①在体外培养条件下，雷帕霉素能增强SKOV3及SKOV3/DDP细胞系对顺铂的敏感性。②m TOR信号通路激活可能在卵巢癌细胞系顺铂耐药机制中起重要作用。③雷帕霉素增强SKOV3细胞系对顺铂敏感性的分子机制包括：增强顺铂所致的DNA断裂、下调抗凋亡蛋白BCL2及引起细胞自噬；雷帕霉素增强SKOV3/DDP对顺铂敏感性分子机制可能与增强顺铂所致的DNA断裂有关。

卵巢癌；雷帕霉素；顺铂耐药；mTOR通路

Oncol prog,2015,13(4)

卵巢癌起病隐匿，确诊时约70%的患者病情已属晚期，治疗效果差[1]。目前，晚期卵巢癌的治疗包括肿瘤细胞减灭术及术后含铂类药物联合化疗，在一定程度上提高了卵巢癌患者的生存率，但其5年平均生存率却在30%左右[2]。研究表明，约70%的卵巢癌患者对首次术后化疗有效，但其中大部分患者2年内出现复发或转移[4-5]。铂类是晚期卵巢癌患者化疗的一线药物，但在治疗过程中会出现耐药。化疗耐药是晚期卵巢癌治疗的难点。

近年发现m TOR通路在卵巢癌顺铂耐药机制中起重要作用[3-4]。作为细胞生存通路，其在细胞增殖、生长、生存和代谢中起重要作用。在生长因子的刺激下，PI3K激活并磷酸化PIP2转化成PIP3，PIP3招募下游AKT分子到细胞膜，使AKT第308位苏氨酸和第473位丝氨酸磷酸化激活，继而使多种底物磷酸化而发挥功能。其中最重要的底物——哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，m TOR）是一种丝/苏氨酸激酶。AKT直接或通过磷酸化抑制TSC2间接激活mTOR。激活的m TOR与m TOR调节相关蛋白形成复合物，激活核糖体40S小亚基S6蛋白激酶并磷酸化抑制4E-BP1，引起蛋白转录增加。该通路异常激活与卵巢癌顺铂耐药的发生有关：透明细胞癌本身就对铂类敏感性差，其p-m TOR的表达比在浆液性腺癌中的高[5]。小干扰RNA敲除AKT基因，使AKT磷酸化激活减少，能增强顺铂对SKOV3细胞增殖的抑制作用[6]。雷帕霉素抑制该通路激活，能增强铂类对卵巢癌细胞系增殖的抑制作用[7]。

本研究选择人卵巢癌顺铂非耐药细胞系SKOV3及顺铂耐药细胞系SKOV3/DDP，采用CCK-8法、克隆平板实验、Western blot等方法检测雷帕霉素对两种细胞系顺铂敏感性的影响，研究m TOR信号通路与SKOV3/DDP顺铂耐药的相关性，初步探究雷帕霉素抑制卵巢癌细胞系增殖的分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料来源

1.1.1 试剂/抗体 顺铂购于齐鲁制药厂；雷帕霉素和单克隆抗体（m TOR、p-m TOR、AKT、p-AKT、PARP、LC3B、BCL2）购于美国CST（Cell Signal Techenology）公司；CCK-8试剂购于碧云天生物技术有限公司。

1.1.2 细胞系和培养条件 SKOV3细胞系及SKOV3/DDP细胞系均购于中国医学科学院肿瘤医院细胞库。两种细胞系均培养于RPM I 1640、10%胎牛血清和1%双抗组成的完全培养基中，在37℃、5%CO2恒温细胞培养箱中孵育。SKOV3/ DDP细胞系采用小剂量顺铂循序诱导耐药，耐药稳定。为保持SKOV3/DDP细胞系对顺铂的耐药性，实验前1周用低浓度顺铂（0.5μg/m l）含药培养基对其进行培养。

1.2 方法

1.2.1 RI测定 取生长良好的SKOV3细胞系，浓度为每毫升5×104个，每孔100μl接种至96孔板，培养过夜后，以含有6个梯度浓度的顺铂培养基替换原培养基（分别为0.3125μg/m l、0.625μg/m l、1.25μg/m l、2.5μg/m l、5μg/m l、10μg/m l），每孔100μl，孵育24 h，每一个浓度设4个平行孔，重复3次。每孔加入CCK-8试剂10μl，孵育2 h。以450 nm波长测定吸光度（OD值）。SKOV3/DDP的测定方法相同。同时设空白组（即含等体积含药培养基及CCK-8试剂，不含细胞），测定细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=[1－（ODexp－OD空白）/（ODctrl－OD空白）]×100%（Exp：实验组，Ctrl：对照组）。用SPSS 16.0软件描绘细胞增殖抑制率与顺铂浓度的关系方程，求出半数抑制浓度（IC50）。RI=IC50SKOV3/DDP/IC50SKOV3。

1.2.2 细胞增殖分析 96孔板中加入生长良好SKOV3细胞，浓度为每毫升2×104个，每孔为100μl，隔日弃去培养基。对照组换用等体积不含药完全培养基，设4个平行孔，重复3次；实验组再分为3组，即雷帕霉素20 nmol/L组（RP 20 nM组）、顺铂5μg/m l组（CIS 5μg/m l组）及雷帕霉素20 nM+顺铂5μg/m l组（联合用药或RP 20 nM+CIS 5μg/m l组），每组亦设4个平行孔，重复3次。每组每孔中分别加入对应的含药培养基各100μl。每组分别设空白组（含等体积对应含药培养基及CCK-8试剂，不含细胞）。采用CCK-8法在24 h、48 h、72 h后测定450 nm波长处的OD值。SKOV3/DDP细胞系分析方法相同。细胞增殖抑制率计算同前。

1.2.3 克隆形成分析 6孔培养板中加入生长良好的SKOV3细胞，浓度为每毫升100个，每孔为2m l，隔日弃去培养基。对照组换用不含药完全培养基2m l，设6个平行孔，重复3次；实验组分3组，即RP 20 nM组、CIS 5μg/m l组及RP 20 nM+CIS 5 μg/m l组，每组设6个平行孔，重复3次，每组每孔中分别加入对应的含药培养基各2m l。实验组每组按药物作用时间不同再分为3组：2 h组、4 h组和24 h组。到达孵育时间后，立即更换不含药完全培养基。14天后，计数细胞克隆（＞50个考虑在内）。克隆形成抑制率=（1－Rexp/Rctrl）×100%（R=细胞克隆数）。

1.2.4 Western blot蛋白分析 细胞培养并离心弃上清，用冰预冷PBS冲洗两次，加蛋白裂解液，4℃冰上裂解15分钟；4℃、12 000 rpm离心机离心10m in，取上清液分装，测蛋白浓度。等量蛋白质通过SDS-PAGE分离，并转移至聚偏氟乙烯膜。TBST配制5%BSA（牛血清白蛋白），将膜浸入，室温下封闭1 h。将各种特异性抗体孵育，4℃过夜；封闭液稀释辣根过氧化酶，标记稀释后的二抗，与膜共同孵育，冲洗。增强化学发光法（enhanced chem ilum inescence，ECL）显色，曝光。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 16.0统计学软件。细胞增殖抑制率、克隆形成抑制率多组比较用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义；采用SPSS拟合细胞增殖抑制率与顺铂浓度之间的线性方程，计算IC50；采用Labworks灰度分析软件分析Western blot图像。

2 结果

2.1 RI计算

如表1所示，顺铂抑制两种细胞系的增殖，随着顺铂浓度的提高，细胞增殖抑制率亦增加。SPSS拟合两者的关系方程：Y1=0.202+0.049X（Y1：SKOV3细胞增殖抑制率；X：顺铂浓度）；Y2= 0.018+0.013X（Y2：SKOV3/DDP细胞增殖抑制率）。IC50SKOV3=6.08μg/m l，IC50SKOV3/DDP=37.08μg/m l。SKOV3/ DDP细胞系RI=IC50SKOV3/DDP/IC50SKOV3=37.08/6.08=6.10。

2.2 不同用药方案对两种细胞系增殖抑制率的影响

表1 顺铂梯度浓度作用24 h两种细胞系增殖抑制率

在SKOV3细胞系中，联合用药及单用顺铂24 h、48 h、72 h，细胞增殖抑制率分别为18%± 4%、54%±9%、79%±1%，以及7%±5%、39%±6%、77%±19%）（图1 A）。其中联合用药组的24 h、48 h细胞增殖抑制率明显高于单用顺铂组，差异有显著的统计学意义（P＜0.01）；两组间的72 h细胞增殖抑制率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

在SKOV3/DDP细胞系中，联合用药及单用顺铂24 h、48 h、72 h，细胞增殖抑制率分别为58%± 7%、77%±3%、79%±4%，以及31%±12%、61%± 23%、64%±3%）（图1 B）。联合用药组24 h、48 h、72 h细胞增殖抑制率明显高于单用顺铂组，其差异有统计学意义（P＜0.01）。

图1 不同用药方案对SKOV3细胞系及SKOV3/DDP细胞系增殖抑制率的影响

2.3 不同用药方案对两种细胞系克隆形成的影响

在SKOV3细胞系中，CIS 5μg/m l、RP 20 nM、联合用药作用2 h、4 h及24 h，其克隆形成抑制率分别为8%±2%、3%±5%、100%±0，7%±9%、4%± 6%、5%±8%及10%±8%、89%±6%、100%±0）（图2 A，图3 A）。

在SKOV3/DDP细胞系中，CIS 5μg/m l、RP 20 nM、联合用药作用2 h、4 h及24 h，其克隆形成抑制率分别为87%±4%、97%±1%、100%±0，48%± 15%、62%±19%、39%±19%及75%±12%、100%±0、100%±0）（图2 B，图3 B）。

多组间的比较采用方差分析，结果如下：SKOV3细胞系，不同方案作用4 h，F=425.89，P＜0.01。多重比较，方差齐，采用LSD检验：CIS 5 μg/m l组vs联合用药组及RP 20 nM组vs联合用药组，差异均有明显的统计学意义（P＜0.01）。SKOV3/DDP细胞系，不同方案作用2 h，F=19.20，P＜0.01。多重比较，方差不齐，采用Tamhane检验：CIS 5μg/m l组vs RP 20 nM组，差异有显著的统计学意义（P＜0.01）；RP 20组vs联合用药组，差异有统计学意义（P＜0.05）。作用4 h，F=22.76，P＜0.01，差异有显著的统计学意义。多重比较，方差不齐，采用Tamhane检验：三组间两两比较，差异均有显著的统计学意义（P＜0.01）。

图2 不同用药方式对SKOV3细胞系及SKOV3/DDP细胞系克隆形成抑制率的影响

图3 细胞克隆平板实验——培养14天后的结晶紫染色

2.4 mTOR通路相关蛋白在两种细胞系中的表达差异

SKOV3细胞系和SKOV3/DDP细胞系的pm TOR、p-AKT、m TOR、AKT灰度值分别为0.334、0.402、1.316、1.183，以及0.938、0.912、1.392、1.310（图4）。灰度分析表明，SKOV3/DDP细胞系比SKOV3细胞系p-m TOR、p-AKT的表达升高，而m TOR、AKT的表达相似。

图4 m TOR通路相关蛋白在两种细胞系中的表达差异

2.5 雷帕霉素联合顺铂对两种细胞系PARP表达的影响

SKOV3细胞系和SKOV3/DDP细胞系单用顺铂组、单用雷帕霉素组、联合用药组PARP的灰度值分别为0.358、0.142、0.517及0.397、0.240、0.845（图5）。灰度分析表明，单用雷帕霉素不引起明显的PARP断裂；联合用药组比单用顺铂组使细胞系PARP断裂增加。

图5 不同用药方案对PARP表达的影响

2.6 雷帕霉素对两种细胞系BCL2及LC3B表达的影响

雷帕霉素作用于SKOV3细胞系及SKOV3/ DDP细胞系各24 h，其BCL2、LC3B灰度值分别为0.623、1.101及0.586、0.378，对照组灰度值分别为1.227、0.451及0.362、0.706（图6）。灰度分析表明，在SKOV3细胞系中，雷帕霉素使BCL2表达下调，使LC3B由LC3BⅠ向LC3BⅡ转化增加；而在SKOV3/DDP细胞系中未发现这两种作用。

图6 雷帕霉素对两种细胞系BCL2和LC3B表达的影响

3 讨论

3.1 雷帕霉素对癌细胞系的作用

本研究显示，SKOV3/DDP细胞系RI为6.10，属顺铂中度耐药，适合进行卵巢癌细胞系顺铂耐药体外研究。Mazzoletti等[8]在卵巢癌细胞系及前列腺癌细胞系中研究发现，雷帕霉素可抑制下游AKT蛋白磷酸化。Lu等[9]提出，雷帕霉素可增强卵巢癌细胞的自噬作用。本研究结果表明，雷帕霉素能明显增强顺铂对SKOV3及SKOV3/DDP细胞系增殖的抑制作用，与文献报道相符合。另外，两种细胞系对雷帕霉素的敏感性也不同。单用RP 20 nM对SKOV3/DDP细胞系增殖抑制作用强，可能与SKOV3/DDP细胞系m TOR通路存在更多激活有关。

3.2 mTOR通路与卵巢癌细胞耐药相关性

当mTOR通路激活时，AKT和m TOR被磷酸化为p-AKT、p-m TOR。Peng等[10]发现顺铂可诱导卵巢癌细胞中PI3K通路的激活，通过抑制AKT或m TOR的表达来增强耐药株对顺铂的敏感性。Wang等[11]发现m icroRNA-199a通过下调mTOR的表达来逆转卵巢癌细胞对顺铂的耐药性。Jeong等[12]发现PI3K在卵巢癌紫杉醇耐药细胞及卵巢癌组织中表达明显增高，以siRNA沉默PI3K表达可通过抑制S期激酶相关蛋白——Skp2的表达，阻断细胞由G1期向S期过渡，从而增强耐药细胞对紫杉醇的敏感性；另建立裸小鼠耐药移植瘤模型，进一步证实了沉默PI3K在体内的化疗增敏作用。本研究数据显示，SKOV3/DDP中p-AKT和pm TOR的表达明显高于SKOV3，推测卵巢癌顺铂耐药可能与m TOR通路激活有关。

3.3 雷帕霉素增强卵巢癌细胞系顺铂敏感性可能的分子机制

铂类耐药机制尚不完全清楚，研究认为由多因素导致，包括：铂类药物与DNA结合不充分、细胞解毒作用增强、DNA修复增强、运载体表达下调、肿瘤细胞染色体改变、癌基因激活及抑癌基因缺失，以及细胞凋亡途径相关基因表达改变，如p53基因[13]。

顺铂能结合细胞DNA，形成链间交联及链内二元N7位加合物，引起DNA损伤，从而抑制DNA复制。大量文献表明，PARP可作为DNA损伤的感受器，它是细胞凋亡的标志[14]。Peng等[10]报道，联用雷帕霉素及顺铂使卵巢癌顺铂敏感株OV433及耐药株OV433-CR PARP断裂增加。Schlosshauer等[7]发现，雷帕霉素能增强卡铂引起的DNA断裂，使PARP表达增加。本研究结果显示，单用雷帕霉素不引起PARP断裂，联合用药比单用顺铂能明显增加PARP的断裂，结果与文献描述相吻合。

目前，学者们已普遍达成共识，细胞对程序性死亡产生抵抗是导致化疗耐药的一个主要原因[15]。BCL2蛋白家族通过线粒体膜外抗凋亡成员和促凋亡成员的比例来控制线粒体膜的完整性，决定细胞的生存与凋亡。细胞自噬涉及可控自噬小体形成，其与溶酶体融合，自噬小体内分子消化，导致细胞死亡。本研究显示：雷帕霉素作用于SKOV3细胞系24 h后，BCL2比对照组的表达降低，LC3BⅠ向LC3BⅡ的转化增加；而作用于SKOV3/DDP细胞系24 h后，BCL2的表达比对照组升高，未发现LC3BⅠ向LC3BⅡ转化。这表明雷帕霉素抑制SKOV3细胞系增殖的分子机制可能与下调抗凋亡蛋白BCL2的表达及引起细胞自噬有关；在SKOV3/DDP细胞系中未发现下调BCL2及细胞自噬作用。

本研究首次采用抗凋亡蛋白BCL2及细胞自噬相关蛋白LC3B研究雷帕霉素增强卵巢癌细胞系SKOV3及SKOV3/DDP顺铂敏感性的分子机制，目前国内外尚未见报道。m TOR信号通路与卵巢癌顺铂耐药相关性及雷帕霉素抑制肿瘤细胞增殖的研究，为学者们认识卵巢癌耐药机制及临床应对卵巢癌顺铂耐药提供了新思路。

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Mechanism of rapamycin increasing the chemosensitivity of ovarian cancer cell lines to cisplatin△

ZHANG Yong-qing1XU Chun-yu1LIRui-rui1LU Jing2JIAO Kun2HUANG Jie3ZHOU Tong-liang4M IAO Jin-wei1#1DepartmentofGynecologicOncology,theBeijingObstetricsandGynecology A ffiliated HospitalofCapitalMedicalUniversity,Beijing100026,China
2Laboratory of PreclinicalMedicine,Schoolof PreclinicalMedicine,CapitalMedicalUniversity,Beijing 100069,China3Laboratory of PreclinicalMedicine,Schoolof PreclinicalMedicine,Ohio State University,Columbia200060,United States4Laboratory of PreclinicalMedicine,Sino-Japanese Friendship Hospital,Beijing 100029,China

ObjectiveThe study is aimed to learn the influence of rapamycin on the sensitivity of cisplatin inovarian cancer cell lines,and to investigate the relationship between them TOR signaling pathway and cisplatin-resistance in ovarian cancer cell lines,besides,themolecularmechanism of the cytotoxic effects of rapamycin on ovarian cancer cell lines is preliminarily explored.MethodThe resistance index(RI)and cell proliferation inhibition rate were analyzed by CCK-8 assay.A fter the adm inistration of different therapies,the influence of colony formation on the two cell lines were evaluated w ith clone tablet experiment.The different expression of proteins in both cell lines were detected using Western blot.Result1)The RIof SKOV3/DDP cell line was 6.10,indicating amoderate resistance to cisplatin.2)In SKOV3 cell line,the cell proliferation inhibition rate of combined therapy groups were significantly higher than that of cisplatin groups after treatment for 24 h and 48 h(P＜0.01),while there was no statistical difference after 72 h treatment(P＞0.05).In SKOV3/DDP cell line,the cell proliferation inhibition rates of combined therapy groupswere significantly higher compared to cisplatin groups in 24 h,48 h,72 h,w ith statistically significant difference(P＜0.01).3)In SKOV3 cell line,when cells were incubated w ith cisplatin+rapamycin for 4h,the colony formation inhibition rate was significantly higher when compared w ith the cisplatin groups(P＜0.01).4)Gray-scale analysis showed that p-mTOR and p-AKT were overexpressed in SKOV3/DDP,while mTOR,AKT had similar expression.5)Rapamycin+cisplatin had more cleavage than cisplatin groups.6)SKOV3 cell line had a decreased expression of BCL2,and an increased transformation from LC3BI to LC3BII when treated w ith rapamycin for 24 hours;And those were not observed in SKOV3/DDP cell line.Conclusion1)In vitro,rapamycin can enhance the chemosensitivity of SKOV3 and SKOV3/DDP cell lines to cisplatin.2)The activation of the m TOR pathway may play an important role in the development of cisplatin-resistance.3)Rapamycin increases the chemosensitivity of SKOV3 cell line to cisplatin,of which the underlying molecularmechanismsmay include:enhancement of cisplatininduced DNA cleavage,downregulation of BCL2 and induce of autophagy,while the mechanisms involved in SKOV3/DDP cell line only include the enhancement of cisplatin-induced DNA cleavage.

ovarian cancer;rapamycin;cisplatin resistance;mTOR pathway

R737.3

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2015.13.04.14

北京市留学人员科技活动择优资助项目（20080002）

#通信作者（corresponding author），e-mail：miaojinweigyn@163.com

2014-12-10）