YDL080C和LEU2基因敲除对工业黄酒酵母异戊醇生成量的影响

李 童,孙军勇,吴殿辉,李晓敏,谢广发,陆 健,5,*

(1.江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡 214122;2.江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡 214122;3.江南大学生物工程学院,江苏无锡 214122;4.中国绍兴黄酒集团有限公司 国家黄酒工程技术研究中心,浙江绍兴 312000;5.宿迁市江南大学产业技术研究院,江苏宿迁 223800)

YDL080C和LEU2基因敲除对工业黄酒酵母异戊醇生成量的影响

李 童1,2,3,孙军勇1,2,3,吴殿辉1,2,3,李晓敏1,2,3,谢广发3,4,*,陆 健1,2,3,5,*

(1.江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡 214122;2.江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡 214122;3.江南大学生物工程学院,江苏无锡 214122;4.中国绍兴黄酒集团有限公司 国家黄酒工程技术研究中心,浙江绍兴 312000;5.宿迁市江南大学产业技术研究院,江苏宿迁 223800)

通过敲除生成途径中关键酶的编码基因,对异戊醇在工业黄酒酵母N85中的生成进行了研究。采用融合PCR技术,分别构建类丙酮酸脱羧酶基因(YDL080C)缺失组件“YDL080C-URA3-YDL080C”和β-异丙基苹果酸脱氢酶基因(LEU2)缺失组件“LEU2-URA3-LEU2”,转化工业黄酒酵母N85尿嘧啶缺陷型单倍体Na-u(MATa ura3),获得单倍体工程菌Na-y和Na-l。将转化子与亲本分别进行实验室规模的黄酒发酵实验,结果YDL080C缺失工程菌的异戊醇含量与亲本相比没有明显变化,说明类丙酮酸脱羧酶不是该途径关键酶;LEU2缺失工程菌的异戊醇含量降低16.16%,说明糖代谢途径存在,但只占小部分,而其他理化指标无明显差异。

异戊醇,工业黄酒酵母,类丙酮酸脱羧酶基因,β-异丙基苹果酸脱氢酶基因,基因敲除

黄酒具有增强记忆能力、增强免疫能力、预防骨质疏松等多种保健功能[1]。然而部分黄酒饮用后容易引起“上头”,主要原因是酵母酒精发酵过程中产生的副产物——高级醇特别是异戊醇含量较高[2]。1907年和1953年研究人员先后提出了高级醇产生的两大途径:一是氨基酸转氨途径(Ehrlich途径),即氨基酸先经过转氨作用形成酮酸,再被脱羧还原形成比原氨基酸少一个碳的高级醇;二是糖代谢途径(Harris途径),即由葡萄糖经EMP途径和TCA循环合成形成氨基酸的前体物——α-酮酸,再通过脱羧还原形成相应的高级醇。异戊醇的两种产生途径如图1所示[3-4]。

Dickenson等[5-7]证实了野生型葡萄酒酵母中异戊醇生成主要通过Ehrlich途径,敲除类丙酮酸脱羧酶的编码基因(YDL080C基因),异戊醇生成量显著降低,证明该酶是该途径中的关键酶。而YDL080C基因缺失的工业白酒酵母工程菌,发酵液中异戊醇含量无明显变化[8],证明该酶并非此途径关键酶,或者异戊醇通过其它途径合成。针对Harris途径,佐一含等[9]构建了LEU2基因(编码β-异丙基苹果酸脱氢酶)缺失的啤酒酵母工程菌,在氨基酸含量较低的培养基中发酵,发酵液中异戊醇含量降低了11.82%,证明工业啤酒酵母中糖代谢途径生成异戊醇的存在,黄酒酵母中是否存在尚无研究。

上述研究结果说明,采用基因工程方法打断异戊醇的代谢通路,对酿酒酵母进行有目的的改造,是降低异戊醇的有效方法,同时,虽同为酿酒酵母,但由于遗传背景不同,不同酒种酿酒酵母中异戊醇的生成途径及关键酶可能存在差异。而目前尚无工业黄酒酵母中异戊醇的生成途径和关键酶的研究。因此,本文针对工业黄酒酵母,采用自克隆技术,以酵母遗传工程中重要的遗传标记URA3为筛选标记[10],通过构建相关酶的编码基因缺失菌株,判断工业黄酒酵母中异戊醇的生成途径,从而降低黄酒中异戊醇含量。

图1 异戊醇生成途径Fig.1 The pathway of isoamyl alcohol biosynthesis注：①:乙酰乳酸酶系；②:二羟酸脱水酶；③:α-异丙基苹果酸合酶；④:β-异丙基苹果酸脱水酶；⑤:β-异丙基苹果酸脱氢酶；⑥:支链氨基酸转氨酶；⑦:丙酮酸脱羧酶；⑧:类丙酮酸脱羧酶。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

工业黄酒酵母N85尿嘧啶缺陷型单倍体Na(MATa ura3) 由本实验室保存,由本实验室从工业二倍体菌株N85中通过敲除HO基因分离获得的单倍体再构建而成;Prime STAR DNA聚合酶、ExTaq DNA聚合酶 宝生物工程(大连)有限公司;DNA胶回收试剂盒 生工生物工程(上海)有限公司;正丙醇、异丁醇、异戊醇、1-辛醇 GCS,Sigma公司;氯化钠 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;无水乙醇 优级纯,国药集团化学试剂有限公司。

YPD培养基用于酵母菌的培养和保存;基本培养基(MM)用于筛选和验证转化子Na-Y和Na-L。

50/30 μmDVB/CAR/PDMS固相微萃取头、手动进样手柄、SPME操作平台 美国Supelco;Talboys数显型磁力加热搅拌器 美国Henry Troemner公司;CNW18-400螺纹口15 mL样品瓶;Agilent GC7890A型气相色谱仪(自带氢火焰离子化检测器) 安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 引物设计与合成 根据NCBI中公布的酿酒酵母URA3基因、YDL080C基因和LEU2基因的核苷酸序列,设计了表1中的扩增引物,所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 本实验中所需的引物

图2 工程菌酵母构建示意图Fig.2 Summary of the construction of an engineering yeast strain

1.2.2 YDL080C基因敲除组件的构建 分别以YC-1/YC-2、YC-3/YC-4、YC-5/YC-6为引物,酵母基因组为模板,用ExTaq DNA聚合酶进行扩增,纯化回收PCR产物获得YDL080C上游同源臂(YC-L)、两端带有重叠序列的“URA3”片段及YDL080C下游同源臂(YC-R)。基于融合PCR的原理[11],采用一种高效构建基因组件的方法[12],以YC-L、“URA3”、YC-R为模板,用Prime STAR DNA聚合酶进行融合PCR反应,再以融合PCR反应的产物为模板,YC-1/YC-6为引物,ExTaq DNA聚合酶进行融合片段的全长扩增,获得YDL080C基因敲除组件,见图2。

1.2.3 LEU2基因敲除组件的构建 分别以L2-1/L2-2、L2-3/L2-4、L2-5/L2-6为引物,酵母基因组为模板,用ExTaq DNA聚合酶进行扩增,纯化回收PCR产物获得LEU2上游同源臂(LEU2-L)、两端带有重叠序列的“URA3”片段及LEU2下游同源臂(LEU2-R)。基于融合PCR的原理,采用一种高效构建基因组件的方法,以LEU2-L、“URA3”、LEU2-R为模板,用Prime STAR DNA聚合酶进行融合PCR反应,再以融合PCR反应的产物为模板,L2-1/L2-6为引物,ExTaq DNA聚合酶进行融合片段的全长扩增,获得LEU2基因敲除组件。

1.2.4 电转化单倍体Na与转化子的鉴定 黄酒酵母转化采用高效电转化法[13],转化后的细胞涂布于现配的MM培养基,倒置于30 ℃培养至转化子长出,分别以YC-1/YC-4、L2-1/L2-4为引物进行菌落PCR初次验证,并对鉴定正确的转化子Na-y和Na-l提取基因组,以YC-1/YC-6、L2-1/L2-6为引物再次验证。回收正确的PCR扩增条带,测序验证。

1.2.5 实验室规模黄酒发酵实验 将工程菌株和出发菌株采用传统方法同时进行实验室规模黄酒发酵实验[14],其中麦曲添加量为14%熟麦曲和3%生麦曲,酵母接种量为5%。

1.2.6 发酵液常规理化指标测定 参考文献[15]的方法。

1.2.7 高级醇的测定 参考已有文献[16-18],采用SPME-GC-FID法测定。HS-SPME操作条件:在15 mL样品瓶中依次加入2.5 g NaCl、6 mL试样、100 μL内标和转子,50 ℃搅拌平衡15 min,迅速将SPME萃取头插入样品瓶,萃取30 min。萃取结束后,取下萃取头插入气相色谱仪进样口解析5 min。气相色谱条件:采用HP-INNOWax毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);不分流进样;进样口温度250 ℃;隔垫吹扫流量 3 mL/min;恒流1 mL/min;检测器温度250 ℃;H2流量:30.0 mL/min;空气流量:400 mL/min;尾吹流量:25 mL/min。柱温程序升温:初始温度40 ℃,恒温4 min后以5 ℃/min升温至120 ℃,再以8 ℃/min升温至220 ℃,恒温2 min。标准曲线:吸取色谱纯的正丙醇、异戊醇、异丁醇等各10、20、30、40、50 μL于100 mL容量瓶中,用15%(v/v)的乙醇溶液定容至100 mL,配成五个梯度溶度的混合标样。吸取50 μL的1-辛醇于50 mL容量瓶,用无水乙醇定容至刻度,配成浓度为834 mg/L的内标溶液。

1.3 统计分析方法

采用Excel 2013进行单因素方差分析,探究数据间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 工程菌的构建与鉴定

2.1.1 基因敲除组件的构建 按1.2.2和1.2.3中所述的融合PCR方法,分别获得基因敲除组件“YDL080C-URA3-YDL080C”和“LEU2-URA3-LEU2”。图3(A、B)的PCR验证结果表明:基因敲除组件大小分别为2328 bp和2224 bp,与预计片段大小相符,已经融合成功。

2.1.2 基因敲除组件转化单倍体Na-y和Na-l的鉴定 尿嘧啶营养缺陷型菌株无法在MM培养基上生长。根据这一特性,将转化子涂布于MM培养,初步鉴定能生长的转化子为转化正确的单倍体。如图4所示。

提取转化子基因组DNA,分别以YC-1/YC-6、L2-1/L2-6为引物,进行PCR扩增验证。如图5所示,转化子有一条2328 bp大小的“YDL080C-URA3-YDL080C”扩增片段,与预期结果相符;而阴性对照只能扩增出1725 bp大小的YDL080C全基因片段,空白对照无任何条带,证明YDL080C基因缺失组件已经整合进酵母工程菌的基因组。同理,图6证明LEU2基因缺失组件已经整合进酵母工程菌的基因组。

表2 不同菌株黄酒发酵实验常规理化指标

注:
注:同一列中,与Na组相比,*表示差异显著(0.01

图3 基因敲除组件的验证Fig.3 The fusion verification of Disruption cassette注:A:YDL080C基因敲除组件的验证;B:LEU2基因敲除组件的验证;1～2:基因敲除组件“YDL080C-URA3-YDL080C”;3～4:基因敲除组件“LEU2-URA3-LEU2”;M:10 kb Marker。

图4 转化子划线于MM上鉴定Fig.4 The verification of transformants on MM plants注:1:转化子Na-y;2:转化子Na-l;3:对照Na-u(尿嘧啶缺陷型单倍体)。

图5 转化子Na-y的PCR扩增鉴定Fig.5 The verification of Na-Y transformants by PCR注:M1:10 kb Marker;M2:2 kb Marker;1～2:转化子PCR产物;3:阴性对照(出发菌株PCR产物);4:空白对照。

图6 转化子Na-l的PCR扩增鉴定Fig.6 The verification of Na-L transformants by PCR注:M1:10 kb Marker;M2:2 kb Marker;1～2:转化子PCR产物;3:阴性对照(出发菌株PCR产物);4:空白对照。

2.2 实验室规模黄酒发酵实验

2.2.1 常规理化指标 不同菌株黄酒发酵实验,各常规理化指标如表2所示。从表2中看出,与出发菌株相比,Na-y的乙醇浓度和总糖差异显著,推测菌体代谢过多总糖引起乙醇含量增多,除此外两种工程菌株发酵的黄酒常规理化指标无明显差异,说明基因敲除对黄酒常规理化指标无显著影响。

2.2.2 高级醇含量 不同菌株发酵实验后测得的高级醇含量如表3所示。与出发菌株相比,YDL080C基因缺失菌株产生的异戊醇含量无明显变化,与郝欣[8]在白酒工业酵母中的研究结果相同,与Dickinson[7]在葡萄酒酿酒酵母中的研究结果不一致,证明黄酒工业酵母中类丙酮酸脱羧酶并不是异戊醇合成的关键酶。另一方面,LEU2基因缺失菌株异戊醇含量降低了16.16%。佐一含[9]在啤酒工业酵母中的研究认为,在氨基酸丰富的情况下,不需要经过糖代谢途径生成氨基酸,所以异戊醇含量没有显著变化。但是黄酒酿造,属于边糖化边发酵,葡萄糖利用率高,糖酵解生成大量丙酮酸,一方面丙酮酸进入三羧酸循环(TCA循环),过程中产生α-酮戊二酸,α-酮戊二酸参与氨基酸转氨途径生成异戊醇(图1);另一方面,丙酮酸及丙酮酸脱羧生成活性乙醛,二者缩合,再经异构、还原、脱水等步骤生成α-酮异戊酸[4],后者与乙酰Co A缩合,再经异构、脱氢、脱羧等反应生成α-酮异己酸,生成异戊醇(图1)。该途径产生的中间物α-酮异己酸较多,因此,黄酒酿造中,LEU2基因的缺失对结果的影响比较显著。可以用来构建低产高级醇的工业黄酒酵母。

表3 不同菌株黄酒发酵实验中高级醇的含量

注:
注:同一行中,与Na组相比,**表示差异极显著(p<0.01),不标者表示差异不显著。

3 结论

本研究从工业黄酒酵母尿嘧啶缺陷型单倍体菌株出发,构建了类丙酮酸脱羧酶(YDL080C)基因缺失菌株和β-异丙基苹果酸脱氢酶(LEU2)基因缺失菌株。实验室规模发酵实验结果表明,YDL080C基因缺失,异戊醇的含量无明显变化;另一方面,LEU2基因缺失,异戊醇的含量降低16.16%。初步认为异戊醇前体物α-酮异己酸由亮氨酸转氨脱羧和糖代谢两条途径生成,其中前者可能是主要来源;α-酮异己酸代谢生成异戊醇途径中,类丙酮酸脱羧酶不是该途径关键酶,推测其同工酶丙酮酸脱羧酶(PDC)可能是关键酶。下一步将对氨基酸转氨途径中编码PDC的基因进行研究,从而进一步揭示工业黄酒酵母中异戊醇的合成机制,为构建低产高级醇黄酒酵母工程菌奠定基础。

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Effect of YDL080C and LEU2 gene knockout on isoamyl alcohol production in industrial yellow rice wine yeast

LI Tong1,2,3,SUN Jun-yong1,2,3,WU Dian-hui1,2,3,LI Xiao-min1,2,3,XIE Guang-fa3,4,*,LU Jian1,2,3,5,*

(1. The Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;3. School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China; 4.National Engineering Research Center for Chinese Rice Wine,China ShaoxingRice Wine Group Co.,Ltd,Shaoxing 312000,China;5. Industrial Technology Research Institute of Jiangnan University in Suqian,Suqian 223800,China)

The production of isoamyl alcohol,was studied in industrial rice wine yeast N85 with the method of gene knockout. Disruption cassette of “ YDL080C-URA3-YDL080C ” and “ LEU2-URA3-LEU2 ” were constructed using fusion PCR,and then electro-transformed into the Δura3 haploid yeast strain(MATa ura3),respectively. Finally the engineered haploids Na-y and Na-l were obtained. Lab-scale fermentation of yellow rice wine was preceded with Na-y and Na-l,respectively. The results showed that the concentration of isoamyl alcohol was almost invariable between the engineered strain Na-y and the parental haploid. On the contrary,the content of isoamyl alcohol was reduced by 16.16% with the engineered strain Na-l. There was no difference in physical and chemical indexes between the engineered strain and parental strain.

isoamyl alcohol;industrial rice wine Saccharomyces cerevisiae;YDL080C gene;LEU2 gene;gene knockout

2014-10-08

李童(1991-)，男，硕士研究生，主要从事酿酒方面的研究，E-mail:litong0201@gmail.com。

*通讯作者:谢广发(1969-),男，硕士，教授级高工，主要从事黄酒的研究，E-mail:xiegf632@126.com。 陆健(1968-)，男，博士，教授，主要从事酿造酒、饲料方面的研究，E-mail:jlu@jiangnan.edu.cn。

食品加工过程安全控制的关键科学问题，973项目(2012CB720802)；工业生物过程高效转化与系统集成的科学基础研究，973项目(2013CB733602)；安全食品精深加工科技创新平台建设(2012B091400030)；食品发酵过程酿酒酵母氮代谢物阻遏效应形成机制及其调控，国家自然科学基金重点项目(31130043)；江苏高校优势学科建设工程资助项目；高等学校学科创新引智计划(111计划)资助项目(111-2-06)；江南大学工业生物技术教育部重点实验室开放课题(KLIB-KF201308)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)15-0189-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.032