紫杉醇参与逆转肺部肿瘤细胞免疫逃逸的机制研究

张桂芝，方向群

（中国人民解放军总医院南楼呼吸科，北京100853）

紫杉醇参与逆转肺部肿瘤细胞免疫逃逸的机制研究

张桂芝，方向群

（中国人民解放军总医院南楼呼吸科，北京100853）

目的分析紫杉醇类抗肿瘤药物紫杉醇参与逆转肺部肿瘤细胞免疫逃逸机制，为治疗肺部肿瘤提供参考。方法采用Lewis肺癌细胞株和紫杉醇（5×108mol/L）处理细胞株抗原肽转运体（TAP），通过流式单抗TAP1及TAP2进行体外试验检测，体内试验分为肿瘤组和化疗组，并设置空白对照组，化疗组小鼠采用Lewis肺癌细胞株经尾静脉注射成瘤，取小鼠肺部组织，采用流式三染法测定调节性T细胞（Treg）。结果经紫杉醇处理的Lewis肺癌细胞株紫杉醇组表面TAP1表达为（5.68±0.65）%，TAP2表达为（89.54±4.81）%，显著高于Lewis肺癌细胞株组的（1.93±0.25）%和（66.84±5.16）%（P＜0.05）；正常小鼠Treg细胞表达为（12.45±1.53）%，显著低于荷瘤小鼠肺部Treg细胞表达的（25.49±2.29）%（P＜0.01）；紫杉醇化疗组小鼠肺部Treg细胞表达为（17.52±2.28）%，显著低于荷瘤小鼠肺部Treg细胞表达（P＜0.05）。结论紫杉醇类抗肿瘤药物紫杉醇可能通过消除肿瘤局部Treg的产生，部分参与逆转肺部肿瘤细胞免疫逃逸机制。

肺部肿瘤；调节性T细胞；紫杉醇

在肿瘤常规治疗中，常用的化学疗法主要通过最大限度杀伤肿瘤细胞达到治疗目的［1］。但化疗药物的使用会在不同程度上损坏机体免疫系统［2-3］。近些年的研究发现，一些化疗药物对患者自身免疫并无太大影响，但能增强肿瘤细胞的免疫活性，并抑制调节性T细胞（Treg），增强机体免疫力［4］。紫杉醇类抗肿瘤药物紫杉醇就是一个代表。本研究中以小鼠为研究对象，探讨了紫杉醇参与逆转肺部肿瘤细胞免疫逃逸的机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料与动物

小牛血清（美国Gibco公司）；重组鼠源性GM-CSF，IL-4（Peprotech公司）；PE-CD11b，APC-B220，PEFoxP3等（Biolegend公司）；FITC-MB1，FITC-Calreticulin，FITC-TAP2等流式一抗（Biotechnologies公司）；流式二抗（DAKO公司）。

1.2 试验方法

将培养的肿瘤细胞分为两组，Lewis肺癌细胞株（3LL，中科院细胞研究所）组的细胞在RPMI-1640完全培养，放置在培养箱中（温度37℃，5%CO2）培养，培养5 d后细胞消化贴壁生长。另外一组细胞为紫杉醇组，采用与Lewis肺癌细胞株同样的培养方法，在细胞贴壁生长5 d后，在培养液中加入5×108mol/L紫杉醇（上海施贵宝制药有限公司，批准文号H20080613，规格为每支16.7mL∶100mg），培养2 d后收集细胞。小鼠购自河北省实验动物中心，许可证编号：SCXK（冀），20080103，C57BL/6，雄性，体重24～35 g；饲养条件为温度20～26℃，相对湿度50%，光照12 h，水瓶每周更换2次。将两组细胞制成细胞悬液，每支细胞悬液管加单细胞（2～5）×106mol/L，采用PBS（北京生物制品研究所，国药准字S10850002，规格为1.0mL）洗涤，在常温下采用多聚甲醛（2%）固定20min，洗涤转移至玻璃试管中，微波处理直至沸腾，冰浴冷冻，采用PBS（含1%BSA）洗涤，样品采用BSA（1%）和PBS（0.1%皂角苷）渗透0.5 h，加入同型对照，加入FITC-TAP1和FITC-TAP2，室温下作用30min，分别采用PBS（含1%BSA）、PBS（0.1%皂角苷）洗涤2次，加入流式二抗，室温下作用30min，再次采用PBS（含1%BSA）、PBS（0.1%皂角苷）洗涤2次，采用多聚甲醛（0.5%）固定，检测。

取0.3×1063LL肿瘤细胞，加入500μL PBS溶液制成悬浮液，通过小鼠尾静脉注入悬浮液，接种后，将小鼠随机分为化疗组、肿瘤组和对照组，3组小鼠尾静脉注射肿瘤细胞8 d后，化疗组小鼠每只接种0.012 5mg紫杉醇，加入500μL PBS溶液制成悬浮液。肿瘤组小鼠胸腔内注射PBS溶液（500μL），作用21 d后，分别取3组小鼠肺部细胞，重复试验3次，空白组小鼠注射等量生理盐水。

混合透明质酸酶、DNA酶和胶原酶，取出小鼠肺部组织细胞，采用眼科手术剪剪碎肺部组织，将组织放置在4.5 mL混合酶中，在培养箱（温度37℃，5%CO2）中培养20 min，取出磨碎，将磨碎后的细胞制成单细胞悬浮液，浓度设定在1×106个/mL。FACS缓冲液洗涤→加入FoxP3固定液→室温作用20 min→缓冲液洗涤→悬浮液→避光反应15min→洗涤，将悬浮液分为5管，设置同型对照，在试管中分别加入FITC-CD11b，PE-CD11b，APC-B220，APC-B220+FITCCD4+PE-FoxP3和生理盐水等各20μL，室温下避光反应30 min，洗涤后分析。CD25及CD4双阳性细胞采用二维点阵图勾勒，确定FoxP3细胞与Treg细胞比例。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件分析。小鼠肺部肿瘤细胞表现抗原肽转运体（TAP）表达、肺部Treg细胞表达以±s表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠肺部肿瘤细胞表面TAP表达

经紫杉醇处理的Lewis肺癌细胞株表面TAP1与TAP2表达显著高于Lewis肺癌细胞株组（P＜0.05），详见表1。

表1 肺部肿瘤细胞表面TAP表达（±s，%）

表1 肺部肿瘤细胞表面TAP表达（±s，%）

组别紫杉醇组Lewis肺癌细胞株组P值TAP1 5.68±0.65 1.93±0.25 0.006 TAP2 89.54±4.81 66.84±5.16 0.036

2.2 流式分析定义Treg细胞

前向散射仪和侧向散射仪参数勾勒所需分析的细胞定为R1，见图1 A；CD25和CD4双阳性细胞定为R2，见图1 B；Treg细胞为R2阳性表达细胞，见图1 C。

图1 Trep细胞流式分析图

2.3 肺部肿瘤局部Treg细胞表达

肺部肿瘤局部Treg细胞表达见图2。其中图2 A为正常小鼠肺部Treg细胞表达，图2 B为生理盐水治疗小鼠肺部Treg细胞表达，图2 C为紫杉醇治疗后小鼠Treg细胞表达，图中黑色表示CD25+CD4+FoxP3+Treg细胞。正常小鼠Treg细胞表达为（12.45±1.53）%，显著低于荷瘤小鼠肺部Treg细胞表达的（25.49±2.29）%（P＜0.01），紫杉醇化疗组小鼠肺部Treg细胞表达为（17.52±2.28）%，显著低于荷瘤小鼠肺部Treg细胞表达（P=0.004）。

图2 肺部肿瘤局部Trep细胞表达图

3 讨论

紫杉醇是从紫衫树皮中提取的具有高效抗肿瘤活性的天然产物，具有明确的抗肿瘤效果，是目前公认的新型抗肿瘤药物［5］。目前对紫杉醇抗癌机制的研究一直是热点，研究紫杉醇参与逆转肺部肿瘤细胞免疫逃逸机制具有显著的理论和应用价值。

紫杉醇是目前肺部肿瘤化疗首选药物，一般认为，紫杉醇能结合到β-微管蛋白N端31位氨基酸，促进微管聚合稳定结构，进而导致细胞周期停滞在G2/M期，实现肿瘤细胞的快速分裂、死亡［6］。也有研究指出，紫杉醇在阻滞肿瘤细胞有丝分裂中，可能通过抑制有丝分裂所需要的微管网正常动态再生而实现抗肿瘤作用。本研究中试图通过紫杉醇对逆转肺部肿瘤逃脱免疫监视来揭示紫杉醇的抗肿瘤作用。

在以往的分析中，关于紫杉醇参与调节性T细胞（Treg）逆转肺癌免疫逃逸的研究国内很少报道。国外有研究指出，紫杉醇可抑制肿瘤细胞诱导巨噬细胞免疫抑制，达到巨噬细胞恢复免疫因子能力［7］。体外研究发现，紫杉醇能促进白细胞介素（IL）-12的产生，纠正肿瘤诱导引起的免疫功能失常。本研究中主要分析紫杉醇对TAP表达和Treg的影响来反映抗肿瘤机制。TAP是参与肿瘤抗原传递重要蛋白质，TAP1和TAP2是其2个重要亚单位，主要负责细胞抗原肽段的转运［8］，其表达下降意味着肿瘤组织复合物表达下降，也就是肿瘤复制出现异常，若肿瘤呈现出弱抗原性，将会导致抗原无法被正常传递给CD8+，从而实现监管免疫。在以往的分析中，肿瘤免疫逃脱机制也包括外周耐受［9］，即肿瘤免疫逃逸通过Treg作用实现，Treg可通过细胞基础依赖性机制抑制免疫细胞功能，也可通过与效应细胞竞争抑制肿瘤细胞的增殖［10］。钟华等［11］在研究紫杉醇作用机制中，通过调节TAP表达可达到抗肿瘤效果，以往研究结果与本研究结果一致。5×108mol/L紫杉醇曾被认为能刺激体内抗原递呈细胞发挥作用，故在本研究中，紫杉醇组小鼠体外注射紫杉醇浓度为5×108mol/L，每只小鼠0.012 5mg，结果经紫杉醇处理的Lewis肺癌细胞株表面TAP1和TAP2表达显著高于Lewis肺癌细胞株组（P＜0.05），提示紫杉醇能上调肿瘤细胞表面MHC-I类分子的表达。在分析紫杉醇对局部Treg细胞表达中，Treg细胞检测分析采用流式三染法技术，结果正常小鼠Treg细胞表达显著低于荷瘤小鼠肺部Treg细胞表达（P＜0.01），紫杉醇化疗组小鼠肺部Treg细胞表达显著低于荷瘤小鼠肺部Treg细胞表达（P=0.004），表明紫杉醇具有抑制消除Treg效果，证实了化疗与自身机体的免疫并不是简单的对抗关系，在药物和剂量合适情况下，能促进肿瘤抗原的暴露，从而促进抗肿瘤免疫应答的发生。

总之，紫杉醇可能部分参与逆转肺部肿瘤细胞免疫逃逸机制，能消除肿瘤局部Treg的产生，化学治疗药物能系统清除肿瘤抗原，提高肿瘤抗原特异性效应细胞比例，提高自身免疫。

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Immune Escape Mechanism s of Paclitaxel Involved in Reversal Lung Cancer Cells

Zhang Guizhi，Fang Xiangqun
（Department of Respiration，South Building，Chinese PLA General Hospital，Beijing，China 100853）

Objective To analyze immune escape mechanisms of paclitaxel involved in reversal lung cancer cells.Methods The cell line antigen peptide transporter（TAP）was processed adopted Lewis lung carcinoma cells lines and paclitaxel 5×108mol/L，in vitro assay was performed by flow through monoclonal TAP1，TAP2.In vivo test was divided into the tumor group and the chemotherapy group，and control group was set.The chemotherapy group was adopted Lewis lung carcinoma cell lines via the tail vein injection into the tumor，the mice lung tissue was selected，the flow was determined by three-regulatory T cells staining（Treg）.Results The TAP1 and TAP2 of Lewis lung cell surface treated by paclitaxel was（5.68±0.65）%and（89.54±4.81）%，which were significantly higher than（1.93±0.25）%and（66.84±5.16）%of the Lewis lung carcinoma cell line group，respectively（P＜0.05），the Treg cells of normal mice was（12.45±1.53）%，which was significantly lower than（25.49±2.29）%of mice lung Treg cells（P＜0.05）；the Treg of cells paclitaxel mice lung was（17.52±2.28）%，which was significantly lower than that of mice lung cells（P＜0.05）.Conclusion Taxol anticancer drugs paclitaxel may eliminate tumors Treg by local regulatory T cells，and partly involved in reversing lung tumor cell immune escape mechanisms.

lung cancer；regulatory T cells；paclitaxel

R285.5；R286

A

1006-4931（2015）22-0041-03

张桂芝（1970-），女，江苏丰县人，博士研究生，副主任医师，主要研究方向为肺部肿瘤诊治，（电话）010-66876230；方向群（1967-），男，浙江淳安人，博士研究生，主任医师，主要研究方向为肺部感染，本文通讯作者，（电话）010-66876230。

2015-05-13；

2015-08-19）