液相色谱仪检定用甲醇中胆固醇标准物质的研制

荀其宁，张文申，侯倩倩，许峰，刘运峰，刘志娟，冀克俭，王家彬

（中国兵器工业集团第五三研究所，济南 250031）

液相色谱广泛应用于大分子化合物、离子型化合物、热不稳定化合物及有机生物活性化合物的分离与分析［1–2］，已成为生命科学、材料科学、环境科学等领域必不可少的重要检测方法［3］。为了保证分析结果准确可靠及可溯源性，必须按照国家检定规程对液相色谱仪进行检定，液相色谱仪经检定合格后方可使用。甲醇中胆固醇溶液标准物质主要用于液相色谱仪示差折光检测器、蒸发光散射检测器的检定［4］。由于该溶液标准物质浓度低，制备技术要求较高，制备方法未见文献报道。市场上的甲醇中胆固醇溶液标准物质已经不能满足需求，为此笔者研制了液相色谱检定用甲醇中胆固醇溶液标准物质。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

电子分析天平：AB135–S型，最大称量为31 g，分度值0.01 mg，梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；

容量瓶：500 mL，A级，经检定合格后使用；

贮存容器：2 mL棕色玻璃安瓿瓶；

气相色谱仪：7890A型，配有氢火焰离子化检测器，安捷伦科技（中国）有限公司；

液相色谱仪：1260型，配有紫外–可见光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器，安捷伦科技（中国）有限公司；

胆固醇：一级纯度标准物质，证书编号为GBW 09203b，纯度为99.7%，相对扩展不确定度为0.1%(k=2)，中国计量科学研究院；

甲醇：色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.2 仪器工作条件

色谱柱：ZORBAX SB–C18色谱柱(250 mm× 4.6 mm，5μm)；检测器：紫外–可见光检测器；流动相：甲醇，流量为1.0 mL／min；分析波长：205 nm；进样体积：20 μL［5］。

2 甲醇中胆固醇溶液标准物质的制备

根据JJG 705 《液相色谱仪检定规程》要求，称取纯度为99.7%的胆固醇国家一级纯度标准物质100.02 mg至500 mL洁净容量瓶中，保持环境温度为(20±2)℃，用甲醇定容至标线，摇匀，即得甲醇中胆固醇溶液。标准物质定值采用重量–容量法，定值结果为200 μg／mL。配制完成后将溶液分装到2 mL棕色安瓿瓶内，溶液标准物质装量为1.5 mL，分装总量为280瓶，粘贴标签后冷藏避光保存。对分装好的标准溶液进行均匀性、稳定性检验。

3 均匀性检验

采用方差分析法进行均匀性检验［6–7］。按封装前后顺序，抽取前5瓶、中间5瓶、最后6瓶共计16瓶样品，在相同的条件下，采用液相色谱法测定胆固醇的含量。每个单元重复测量3次，当显著性水平α=0.05时，查表得临界值F0.05，(15，32)=1.97。甲醇中胆固醇均匀性检验统计结果见表1。由表1数据计算得，组间方差和Q1=2.072 2，组内方差和Q2=8.173 7，F =0.54，F

表1 甲醇中胆固醇溶液均匀性检验数据 μg／mL

4 稳定性检验

稳定性是在不同的时间积累特性值的稳定性。该标准物质在低温（4℃）及避光的保存条件下，在2012～2014年间进行了24个月连续测定。按照前密后疏的时间间隔［8］，从均匀性检验合格的剩余单元中随机抽取3个单元即3瓶，采用液相色谱法每支重复测定3次，计算其平均值及标准偏差。

依据文献［6］规定，用回归曲线法进行稳定性监测。即以时间为横坐标，测定值为纵坐标进行线性拟合，得直线斜率为β1，对于稳定的标准物质，β1的期望值为零，基于β1的标准偏差，可用t检验(自由度为n–2)进行判断：若| β1|

表2 甲醇中胆固醇溶液的稳定性考察结果

5 定值

甲醇中胆固醇标准物质采用重量–容量法定值，根据胆固醇的纯度值、称取的质量和溶液定容体积确定其特性量值。该标准溶液的准确浓度按式(1)计算：

式中：ci——溶质i的浓度，μg／mL；

mi——溶质的质量，μg；

qi——溶质的纯度，用质量分数表示，%；

V——溶液的体积，mL。

经过计算，甲醇中胆固醇标准物质的定值结果为200 μg／mL。

6 定值结果的不确定度

甲醇中胆固醇溶液标准物质定值结果不确定度来源分析及不确定度评定按文献［9–10］进行。

6.1 不确定度的来源

甲醇中胆固醇溶液标准物质浓度的不确定度主要来源有三部分：定值引入的不确定度；溶液的均匀性引入的不确定度；溶液稳定性引入的不确定度。

6.2 不确定度的评定结果

6.2.1 定值引入的不确定度

定值引入的不确定度来源主要是溶质胆固醇纯度引入的不确定度、天平称量引入的不确定度和溶液体积引入的不确定度，各分量数值见表3。由各分量合成得定值引入的标准不确定度为0.32%。

表3 定值引入的相对不确定度 %

6.2.2 均匀性引入的不确定度

由表1数据计算得甲醇中胆固醇溶液标准物质均匀性引入的相对标准不确定度u2=0.15%。

6.2.3 稳定性引入的不确定度

由表2数据计算得甲醇中胆固醇溶液稳定性引入的相对标准不确定度u3=0.46%。

甲醇中胆固醇溶液的合成相对标准不确定度：

相对扩展不确定度：U=kuc=2%（k=2）。

7 量值比对

选用国家标准物质研究中心生产的二级标准物质作为标准，与同浓度的甲醇中胆固醇配制溶液物质进行量值比对，比对结果见表4。

表4 配制溶液与其它标准物质量值比对结果

由表4数据可知，与现有标准物质比对，甲醇中胆固醇溶液的相对误差为0.2%，远远小于其定值的不确定度2%，说明采用重量–容量法配制的标准物质其量值是准确可靠的。

8 结语

研制的200 μg／mL的甲醇中胆固醇溶液标准物质量值准确，均匀性及稳定性良好，可用于液相色谱仪示差折光检测器、蒸发光散射检测器的检定。

［1］郑玲，李丽华，郭蔚，等.高效液相色谱法测定食品中的甜蜜素［J］.化学分析计量，2005，15(3): 50–51.

［2］苏新国，王宁生，蒋跃明，等.食品中金属元素高效液相色谱检测技术研究进展［J］.食品科学，2006，27(11): 523–528.

［3］宋虎跃，徐国栋，吴勇民.高效液相色谱技术的应用［J］.内蒙古石油化工，2007(6): 17–18.

［4］JJG 705–2014 液相色谱仪检定规程［S］.

［5］李黎，刘玉峰，唐华澄，等.高效液相色谱法测定食品中的胆固醇［J］.食品科学，2007，28(4): 289–291.

［6］JJF 1343–2012 标准物质定值的通用原则及统计学原理［S］.

［7］全国标准物质管理委员会.标准物质定值原则和统计学原理［M］.北京：中国质检出版社，2011.

［8］JJF 1006–1994 一级标准物质技术规范［S］.

［9］JJF 1135–2005 化学分析测量不确定度评定［S］.

［10］国家质量技术监督局计量司组.测量不确定度评定与表示指南［M］.北京：中国计量出版社，2005.