脂多糖对人脐血内皮祖细胞增殖及凋亡的影响

李金海，陈辉春，戴华卫，张海峰，王烈

（1.温州医科大学附属第三医院 普外科，浙江 温州 325200；2.南京军区福州总医院 普外科，福建福州 350025）

·论 著·

脂多糖对人脐血内皮祖细胞增殖及凋亡的影响

李金海1，陈辉春1，戴华卫1，张海峰1，王烈2

（1.温州医科大学附属第三医院 普外科，浙江 温州 325200；2.南京军区福州总医院 普外科，福建福州 350025）

目的：观察脂多糖（LPS）对体外培养的人脐血内皮祖细胞（EPCs）增殖及凋亡的影响。方法：以密度梯度离心法获取人脐血EPCs，体外诱导分化并鉴定。实验分对照组及不同浓度（2.5、5.0、10.0、20.0 mmol/L）LPS组。四氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖能力，流式细胞仪测凋亡率及细胞周期。结果：①10.0 mmol/L组促进EPCs增殖，20.0 mmol/L组抑制EPCs增殖，差异有统计学意义（P＜0.05），其余2组对EPCs增殖能力无显著影响，与对照组比差异无统计学意义（P＞0.05）。②20.0 mmol/L组促进EPCs凋亡，差异有统计学意义（P＜0.05）。其余各组对EPCs凋亡率无明显影响，与对照组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。③10.0、20.0 mmol/L组影响细胞周期，10.0 mmol/L组G0/G1期细胞减少，S和G2/M期增加；20.0 mmol/L组发生S期阻滞，G2/M期细胞减少，与对照组比差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：LPS对EPCs增殖能力及凋亡的影响与其浓度有关，当浓度为20.0 mmol/L时抑制增殖并促进凋亡。

脂多糖；内皮，血管；细胞增殖；细胞凋亡

内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）作为血管内皮细胞的前体细胞，在血管修复及新生血管形成过程中发挥重要作用，因此在治疗缺血性疾病方面有着广阔的应用前景[1]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰阴性菌细胞壁的重要成分，影响细胞自噬，对细胞的增殖能力及凋亡的把控是当今研究的热点[2-3]。本研究探讨各种浓度的LPS对人脐血EPCs分化增殖、凋亡及细胞周期的影响。

1 材料和方法

1.1 材料 脐带血取自2012年7月-2013年7月温州医科大学附属第三医院妇产科健康产妇，均经产妇知情同意，并经医院伦理委员会许可。淋巴细胞分离液（美国R&D System公司）；EGM-2MV EPCs培养基（杭州百通生物公司）；LPS、四氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）（均为德国Roche公司），DiI-acLDL（美国Molecular Probe公司），FITC-UEA-I（美国Fermentas Life Science公司），Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（北京宝赛生物技术有限公司）；DNA含量检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 EPCs培养：取产妇脐带血50 mL，用等倍的PBS稀释后，按1∶1比例加入淋巴细胞分离液，离心后取出单个核细胞层，用PBS清洗，滴加EPCs培养基（EGM-2MV），以1×106个/cm2密度接种于包被有人纤维连接蛋白的培养瓶中，5% CO2、37 ℃环境下培养3 d。用PBS液洗掉非贴壁细胞，收集贴壁细胞备用。

1.2.2 EPCs鉴定：将贴壁细胞与浓度为2.4 μg/ mL Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-acLDL）在37 ℃孵育1 h后用2%多聚甲醛固定；再将浓度为10 μ g/mL FITC标记的荆豆凝集素-I滴加于上述标本中37 ℃孵育1 h，向已染色的标本上滴加1 μ g/mL Hoechst 33342，避光孵育2 h；PBS冲洗3次，蒸馏水冲洗1次，滴加缓冲甘油封片。通过激光共聚焦显微镜鉴定Dil-acLDL和结合FITC-UEA-I双染色阳性细胞为正在分化的EPCs。

1.2.3 实验分组：将培养3 d的贴壁细胞消化、重悬后分5组：对照组（仅加入EGM-2MV）及在培养基的基础上加入不同浓度LPS组（2.5、5.0、10.0、20.0 mmol/L组），培养48 h后，收集细胞。各组用细胞计数器计数对细胞数量进行调整，使各组间细胞基数相等。

1.2.4 EPCs增殖能力检测：以（1.5～2.0）×104细胞/孔的密度在在96孔培养板上将细胞接种。每组6孔，每孔100 μL，每组均设6复孔。培养终止前4 h加入MTT（5 mg/mL），10 μL每孔，37 ℃培养4 h后终止，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL，振荡20 min后，让结晶物充分溶解。酶标仪测波长为570 nm时的吸光度A值，重复3次。

1.2.5 Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率：严格按Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒进行操作，将培养3 d的贴壁细胞消化后收集，加PI染液10 μL，Annexin V-FITC染液5 μL，37 ℃孵育10 min，实验重复3次，上机检测。将贴壁细胞消化、离心后收集细胞（浓度为5×105个/cm2），70%冷乙醇4 ℃固定，加入结合缓冲液490 μL，混匀，4 ℃保存；加RNase A，37 ℃水浴30 min；再加入PI染色均匀，4 ℃避光30 min，放入流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。结果以±s表示，每组重复3次，各组样本数据比较采用方差齐性检验，2组间比较采用配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EPCs鉴定 根据EPCs具有摄取acLDL和结合UEA-I的能力，收集培养3 d的贴壁细胞，激光共聚焦显微镜鉴定经FITC-UEA-I和DiI-acLDL单克隆抗体标记的EPCs，DiI-acLDL染色阳性细胞呈红色，FITC-UEA-I染色阳性细胞呈绿色，FITC-UEA-I和DiI-acLDL双染色阳性细胞视为正在分化的EPCs，呈黄色（见图1）。

图1 双荧光染色鉴定EPCs（×400）

2.2 EPCs增殖能力及凋亡的检测 LPS作用48 h对EPCs增殖能力的影响：与对照组比较，10.0 mmoL/L组细胞增殖能力明显增强，差异有统计学意义（t= 5.43，P＜0.05）；20.0 mmoL/L组细胞增殖能力明显下降，差异有统计学意义（t=3.01，P＜0.05）；2.5 mmol/L、5.0 mmoL/L组与对照组比较，差异无统计学意义（分别t=0.38、t=0.72，均P＞0.05）（见表1）。LPS作用48 h对EPCs凋亡的影响：2.5 mmoL/L、5.0 mmoL/L、10.0 mmoL/L组与对照组凋亡率比较，差异无统计学意义（分别t=1.98、t=2.77、t=3.22，均P＞0.05）；20.0 mmoL/L组与对照组比较凋亡率明显增加，差异有统计学意义（t=5.14，P＜0.05）；10.0 mmoL/L与20.0 mmoL/L组比较，细胞增殖差异有统计学意义（t=8.14，P＜0.05），凋亡率差异亦有统计学意义（t=5.89，P＜0.05）（见表1）。

表1 LPS作用48 h对EPCs增殖及凋亡的影响（n=3，±s）

表1 LPS作用48 h对EPCs增殖及凋亡的影响（n=3，±s）

与对照组比：aP＜0.05；与10.0 mmoL/L组比：bP＜0.05

2.3 LPS对EPCs细胞周期的影响 LPS作用48 h，其浓度为2.5 mmoL/L、5.0 mmoL/L时，EPCs主要积聚于G0/G1期，G0/G1、S期、G2/M期细胞数与对照组比较，差异无统计学意义（分别t=1.45、t=0.65、t=1.51、t=3.37、t=0.51、t=0.68，P＞0.05）；LPS浓度为10.0 mmoL/L，S期及G2/M期细胞数增加，G0/ G1期细胞数减少，各期细胞数与对照组比较，差异有统计学意义（分别t=6.12、t=4.48、t=11.42、t=8.56、t=27.18、t=6.77，P＜0.05）；10 mmoL/L 与20 mmoL/L组G0/G1期细胞数比较，差异无统计学意义（t=1.78，P＞0.05），S期、G2/M期细胞数比较，差异有统计学意义（分别t=6.98、t=9.12，P＜0.05）（见表2）。

表2 LPS对EPCs周期的影响（n=3，±s，%）

表2 LPS对EPCs周期的影响（n=3，±s，%）

与对照组比：aP＜0.05；与10.0 mmoL/L组比：bP＜0.05

3 讨论

EPCs作为血管内皮细胞的前体细胞，在缺血疾病、创伤愈合及血管内皮修复中发挥重要作用，探寻影响其增殖及凋亡的物质有着重要的临床意义[4]。在机体受到创伤后，受损的细胞会自发形成自噬泡，溶酶体与自噬泡结合形成自噬小体，后者被体内一些酶类分解为小分子物质后发挥修复、愈合创伤细胞的作用。所以，自噬是细胞在应激状态下的一种自我保护机制，对机体稳态的维持有重要意义。已有研究证实，LPS可通过直接诱导及间接激活途径参与细胞的自噬过程，这些途径可能均与活性氧反应有关，但具体机制尚不清楚[5]。

本研究显示，药物作用48 h后与对照组比较，浓度为2.5、5.0 mmoL/L的LPS对EPCs增殖及凋亡均无显著影响，差异无统计学意义（P＞0.05），EPCs多停滞于G0/G1期；在G0/G1期、S期、G2/M期，EPCs在的细胞数量方面与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。对比对照组，10.0 mmoL/L的LPS可显著提高EPCs的增殖能力，差异有统计学意义（P＜0.05），对EPCs凋亡影响不显著，差异无统计学意义（P＞0.05），EPCs数量在G0/G1期减少，而在S和G2/M期增加，且差异有统计学意义（P＜0.05），所以，EPCs向S期及G2/M期分化过程中，10.0 mmoL/L 的LPS发挥显著促进作用，进而促进EPCs增殖能力。对比对照组，20.0 mmoL/L的LPS可抑制EPCs增殖能力，并促进其凋亡，差异有统计学意义（P＜0.05）；对比对照组，细胞主要集聚于S期，且G2/M细胞数量下降，差异有统计学意义（P＜0.05），证实细胞被阻滞于S期可能，导致细胞进一步分化受到抑制，抑制细胞增殖。上述实验结果证实，对比对照组，相对偏低浓度（2.5、5.0 mmoL/L）的LPS对EPCs的增殖能力及凋亡无明显影响；中等浓度（10.0 mmoL/L）的LPS可明显促进EPCs增殖能力，在凋亡方面对EPCs无明显影响；较高浓度（20.0 mmoL/L）LPS可明显抑制细胞增殖能力，并显著促进细胞凋亡。

自噬是细胞应对不利生存条件下的一种防御反应，对细胞有保护作用，并参与免疫应答；凋亡是细胞不能耐受外界有害刺激时出现的主动性死亡[6-7]。自噬多发生于凋亡之前，他们都是维持稳态的重要机制，虽然细胞自噬性死亡在机制和形态学上均不同于凋亡，但二者在信号通路上存在某些交叉，二者的诱发因素也有很大程度的一致性，且均与细胞的自我调节功能有关[8-9]。结合本研究，随着LPS浓度的不断增加对EPCs增殖能力并没有相应得到促进，考虑细胞为维持自身稳态，对自噬功能进行自我调节有关，其具体机制也是我们下一步研究的重点。EPCs的凋亡与LPS浓度呈现一定的依赖性，考虑较大剂量的药物浓度导致细胞中毒，超越细胞自我调节的限度，致使细胞凋亡[10]。因此，自噬的调控只能局限于一定药物浓度范围，过量的药物浓度致使自噬被过度抑制，将可能导致细胞凋亡。由此相信，若能找到LPS对ECPs作用的最适合药物浓度，就可能有效控制EPCs的增殖能力及凋亡。随着研究的不断深入，LPS对于EPCs生物学特性的影响也将成为日后缺血性疾病干预的重要靶点。

[1]Bruyndonckx L, Hoymans VY, Frederix G, et al.Endothelial progenitor cells and endothelial microparticles are independent predictors of endothelial function[J].J Pediatr, 2014, 165(2): 300-305.

[2]Wang J, Feng X, Zeng Y, et al.Lipopolysaccharide (LPS)-induced autophagy is involved in the restriction of Escherichia coli in peritoneal mesothelial cells[J].BMC Microbiol, 2013, 13: 255.

[3]Hagiwara S, Iwasaka H, Koga H, et al.Stimulation of autophagy in the liver by lipopolysaccharide-induced systemic infammation in a rat model of diabetes mellitus[J].Biomed Res, 2010, 31(5): 263-271.

[4]Yoo CH, Na HJ, Lee DS, et al.Endothelial progenitor cells from human dental pulp-derived iPS cells as a therapeutic target for ischemic vascular diseases[J].Biomaterials, 2013, 34(7): 8149-8160.

[5]Li S, Zhou Y, Fan J, et al.Heat shock protein 72 enhances autophagy as a protective mechanism in lipopolysaccharide-induced peritonitis in rats[J].Am J Pathol, 2011, 179(6): 2822-2834.

[6]Ma Y, Galluzzi L, Zitvogel L, et al.Autophagy and cellular immune responses[J].Immunity, 2013, 39(2): 211-227.

[7]黄晓燕, 陈碧新, 高瞻, 等.自发性高血压大鼠视网膜微血管稀少与细胞凋亡[J].温州医学院学报, 2010, 40(2): 111-114.

[8]刘斯灵, 郝亚荣.脂多糖诱导的自噬在心血管方面的研究进展[J].心血管病学进展, 2011, 32(6): 834-836.

[9]McMillan EM, Quadrilatero J.Autophagy is required and protects against apoptosis during myoblast differentiation[J].Biochem J, 2014, 462(2): 267-277.

[10] 朱人大, 李晓强, 孟庆友, 等.3-甲基腺嘌呤对大鼠内皮祖细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响[J].中华普通外科杂志, 2011, 29(7): 562-565.

（本文编辑：胡苗苗）

Effects of lipopolysaccharide on proliferation and apoptosis in human umbilical vein endothelial progeni-tor cells

LI Jinhai1, CHEN Huichun1, DAI Huawei1, ZHANG Haifeng1, WANG Lie2.1.Department of General Surgery, the Third Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325200; 2.Department of General Surgery,Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command, Fuzhou, 350025

Objective:To investigate the effect of proliferation, apoptosis and cell cycle of lipopolysaccharide (LPS) on human umbilical vein endothelial progenitor cells.Methods:mononuclear cells were isolated from human umbilical cord blood.Mononuclearcells (MNCs) were isolated from human umbilical cord blood in vitro by Ficoll density gradient centrifugation.EPCs were characterized as adherent cells with double positive to DiI-acLDL uptake and lectin binding by direct fuorescent staining under a laser scanning confocal microscope.There were fve groups.The control group and four LPS concentration groups: 2.5, 5.0, 10.0, 20.0 mmol/L.MTT was used to detect cell apoptosis and cell cycle.Results: ①10.0 mmol/L LPS promotes proliferation of EPCs, while 20.0 mmol/L LPS inhibits the proliferation of endothelial progenitor cells (P＜0.05).②20.0 mmol/L LPS promotes apoptosis of EPCs, compared with the control, the difference was signifcant (P＜0.05).③LPS at the concentration of 10.0 mmol/L reduces cells at G0/G1phase and increases S and G2/M phase cells; 20.0 mmol/L LPS induces EPCs blockade at S phase, G2/M phase cells decreased, compared with the control, the difference was signifcant (P＜0.05).Conclusion:10.0 mmol/L LPS promotes the proliferation of EPCs.20.0 mmol/L LPS inhibits the proliferation and promotes apoptosis of EPCs.

lipopolysaccharide; endothelium, vascular; proliferation; apoptosis

R331.3

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.02.008

2014-06-03

福建省自然科学基金资助项目（2009J01186）。

李金海（1983-），男，山东枣庄人，主治医师，硕士。

王烈，主任医师，博士生导师，Email：lijindahai@ 126.com。