先天梅毒实验室诊断方法学研究

先天梅毒实验室诊断方法学研究

苗 岩 欧春怡 王 伟 李 卓 王学斌 齐绍伟

目的研究先天梅毒实验室检测实用性、特异性的方法，应用于新生儿梅毒的早期诊断。方法应用国内外最新的梅毒检测技术，以梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验（TPPA）与甲苯胺红不加热血清试验 （TRUST）作为基础实验，辅以其它特异性诊断实验，达到快速、准确、特异的诊断目的。结果2010～2014年全院共检测门诊及住院患者66 338例，其中，产科住院孕产妇30 225例，产科门诊孕产妇10 250例，针对性检测临床疑似新生儿梅毒感染患儿189例，其中住院孕产妇双阳性率（TPPA、TRUST均阳性）0．36%，产科门诊孕产妇双阳性率0．63%，疑似新生儿梅毒感染患儿阳性率19．58%。检出新生儿梅毒患儿11例，约占住院孕产妇0．36‰。结论使用逆向操作法应用于常规梅毒组合检测，采用蛋白印迹技术针对性检测，提高了孕产妇及新生儿梅毒检测的特异性，应用于新生儿胎传梅毒的早期诊断可为临床诊断先天梅毒提供依据。

苍白密螺旋体；先天性梅毒；蛋白印迹技术；实时荧光定量PCR

1 材料与方法

1.1 标本来源

2010年1月～2014年12月本院所有门诊及住院患者66 338例。所有阳性血清标本均冰冻保存2年以上，以备复检。

1.2 试剂

TPPA试剂由日本富士瑞必欧株式会社提供，TRUST试剂由上海荣盛生物技术有限公司提供，免疫印记法（WB）所使用的抗梅毒螺旋体（IgM）检测试剂盒由德国欧蒙医学实验诊断股份公司提供。ELISA检测试剂盒由北京万泰生物科技有限责任公司提供。实时荧光定量PCR（FQ-PCR）方法试剂盒由中山大学达安基因股份有限公司提供。

1.3 诊断方法

依据卫生部2007年颁布的中华人民共和国卫生行业标准WS273-2007《梅毒诊断标准 》。

1.4 检测程序

住院孕产妇患者首先采用TPPA方法进行检测，阳性患者做TRUST 1：2 ～ 1：128倍血清稀释，其滴度可作为疗效观察的判断指标。采用这种逆向操作的方法，即保证了试验方法的准确性和特异性，又提高了检验速度。对于孕产妇双阳的患者，加做WB检测，出生患儿也采用蛋白印迹进行检测，同时辅以FQ-PCR进行检测，加作ELISI方法进行比对试验，对于无临床体征及症状的出生后患儿进行跟踪随访1年以上，用以排除胎传梅毒。所有实验步骤及结果判读均严格按照试剂盒使用说明书进行操作，且由2人分别判读。

2 结果

2.1 梅毒血清学检测结果及方法学比较

梅毒血清学检测结果及方法学比较详见表1，表2。

2.2 阳性检出率及构成比

自2010年1月～2014年12月全院门诊及住院患者梅毒检测标本共计66 338例。其中产科门诊检测10 250例，单阳（仅TPPA阳性）181例，阳性率1.77%，构成比16.41%；双阳（TPPA、TRUST均阳性）68例，阳性率0.66%，构成比9.3%。产科住院检测30 225例，单阳127例，阳性率0.42%，构成比11.51%；双阳110例，阳性率0.37%，构成比15.06%。疑似新生儿梅毒感染患儿检测189例，单阳129例，阳性率68.25%，构成比11.7%；双阳37例，阳性率19.58%，构成比5.06%。确诊新生儿梅毒11例，约占住院孕产妇0.36‰。

2.3 TRUST滴度

采用5种方法，配对检测166例产科住院分娩的母婴标本，其中母亲双阳110例，单阳56例。检测出婴儿单阳129例，双阳37例。确诊新生儿梅毒11例，其TRUST滴度均≥母体血清滴度。

3 讨论

当人类感染苍白密螺旋体后，最先刺激机体产生IgM抗体，患者一般感染2周后即可检出，而IgG则在感染4周后方可测出，感染时间少于3周，血清学检测可能出现阴性即所谓的窗口期，妊娠梅毒的筛查工作应每月进行1次，苍白密螺旋体IgG分子量较小，能够穿透胎盘屏障，所以母亲TPPA检测单阳或双阳，一般新生儿出生后抗体（IgG）检测均为阳性，6个月～1年后可自然消失。因此，选择WB或FQ-PCR的方法检测人体内IgM抗体，用于苍白密螺旋体感染的早期诊断是目前诊断先天梅毒最好的实验诊断方法。特别是对于无临床症状的新生儿，亦不能排除胎传梅毒的可能性，应用两种方法联合检测更为有效。

表1 166例新生儿母子（女）梅毒血清学检测结果

表2 5项检测方法敏感度、特异度（%）

ELISA方法检测的是IgG和IgM的混合抗体，用于自动化检测系统大批量筛查，对于孕产妇及新生儿检测，敏感度和特异度相对较差，无法满足临床特殊需求。TRUST方法检测的是非特异抗体，仅适合用于疗效观察，通常认为新生儿TRUST滴度高于母亲4倍，高度怀疑先天性梅毒［1］。本研究结果提示，只要新生儿TRUST滴度＞1：16，或子（女）TRUST滴度高于母亲滴度，均应高度怀疑先天梅毒，应用WB（IgM）方法进行最后确认。TPPA检测的是IgG抗体，特异性高，假阳性少，可作为梅毒的确证实验，但只要感染苍白密螺旋体，此抗体一般会终生携带，针对梅毒早期诊断缺陷明显［2］。FQ-PCR应用于先天梅毒检测具有特异度、敏感度高、定量准确的特点，特别是PCR技术能够检出临床标本TP-DNA，提示低载量感染，如果患者同时存在HIV感染时，会出现假阴性，此方法检测脑脊液是证实感染的唯一方法［3-4］，但是应用此项技术，需建立高质量的PCR实验室及配套实验设备，只适合于较大的三甲级医院开展，普通基层医院难以普及。采用WB方法检测IgM抗体，具有操作简便、快速准确的特点，且无抗体交叉反应的干扰，溶血、脂血、黄疸对检测结果均无影响。本研究结果显示应用蛋白印记检测技术检测IgG和IgM敏感度和特异性均为100%。欧蒙试剂厂家给出的WB（IgM）检测试剂盒特异性为98%，敏感度为100%，有可能与我们检测的样本量较小有关，有待于增大样本量，做进一步的观察和研究。阳性预测值为94%，所以在诊断新近感染时，IgM阳性标本，最好在3～6周后重新检测患者血液样本WB（IgG）是否为阳性。

从优生学角度考虑，一旦母亲发生梅毒螺旋体感染，TRUST滴度＞1：16，胎儿IgM检测阳性，发生宫内感染机会较大，一般妊娠预后较差，采取引产方式终止妊娠为宜。近十年来，我们采用入院孕产妇患者首先检测TPPA，阳性标本做TRUST滴度，无论单阳或双阳母婴均做WB（IgM）检测，提高了先天梅毒检测的灵敏度、准确度及检出效率，及时为临床选择治疗时机及终止妊娠提供参考，减少院内感染率的发生，同时为流行病学调查提供参考依据。

［1］苗岩，欧春怡，任惠斌，等． 41482株苍白密螺旋体血清学检测结果分析［J］． 中华医院感染学杂志，2011，21（4）：829-830．

［2］苗岩，欧春怡，王学斌，等． 先天性梅毒实验室检测方法学评价［J］． 中华全科医学杂志，2012， 10（7）：1137-1138．

［3］欧春怡，苗岩，祖虹． 新生儿先天性梅毒的实验室诊断与临床应用［J］． 中华儿科杂志，2011，49（11）：869-871．

［4］Gayet-Ageron A，Ninet B，Toutous-Trellu L，et al． Assessment of a real-time PCR test to diagnose syphilis from diverse biological samples［J］． Sex Transm Infect，2009，85（4）：264-269．

Laboratory Diagnosis and Methodology Research on Congenital Syphilis

MIAO Yan OU Chunyi WANG Wei LI Zhuo WANG Xuebin QI Shaowei Clinical Laboratory of Red Cross Central Hospital，Harbin 150076，China

ObjectivePractical and specificity of laboratory testing on congenial syphilis are to be researched in order to apply it to diagnose early-stage congenial syphilis in new-born babies．MethodsApplication of abroad latest laboratory testing technique based on TPPA and TRUST， and supplemented other specific laboratory tests in order to make the rapid，accurate and specified diagnosis．ResultsThere are totally 66 338 patients treated clinically and hospitalized from 2010 to 2014，including 30 223 cases of hospitalized pregnant patients，10 250 cases of clinically treated pregnant patients and 189 cases of clinically suspected congenial syphilis new-born babies． TPPA and TRUST of hospitalized pregnant patients were up to 0．36%，while，TPPA and TRUST of clinically treated pregnant patients were up to 0．63%． And the positive rate of suspected newborn babies infected with congenital syphilis was 19．58%，there are 11 newborn babies diagnosed as congenital syphilis，accounting for 0．36‰ of pregnant patients in total．ConclusionApplication of reverse operation to test routine syphilis and application of western blotting to test specific syphilis are conducive to increasing specificity of syphilis test for pregnant women as well as newborn babies，and what’s more，the early-stage diagnosis of newborn babies could provide basis for clinical diagnosis of congenital syphilis．

Treponema pallidum，Congenital syphilis，Protein imprinting technology，Real-time fluorescent quantitative PCR

R759．152

B

1674-9316（2015）27-0139-02

10．3969/j．issn．1674-9316．2015．27．102

150076 哈尔滨市红十字中心医院检验科

苗岩，E-mail：miaoyan6565@163．com

黑龙江省卫生厅科研课题项目（项目编号：2012-069）哈尔滨市科技创新人才研究专项资金项目（项目编号：2012RFQYS055）