黄金胶囊对糖尿病大鼠血糖和肝细胞PI-3K、 GLUT-4蛋白表达的影响*

康学东，张瀚文，余臣祖

(1.甘肃中医药大学附属医院内分泌糖尿病科，甘肃 兰州730020； 2.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000)



·实验研究·

黄金胶囊对糖尿病大鼠血糖和肝细胞PI-3K、 GLUT-4蛋白表达的影响*

康学东1，张瀚文2，余臣祖2

(1.甘肃中医药大学附属医院内分泌糖尿病科，甘肃 兰州730020； 2.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000)

摘要目的：观察黄金胶囊对糖尿病大鼠肝细胞中磷脂酰肌醇3激酶( phosphatidylinositol-3-kinase,PI-3K)、葡萄糖转运因子4( glucose transporter 4,GLUT4)的表达的影响。方法：选取48只SPF级大鼠，随机抽取12只为空白对照组，其余给予高脂饲料和小剂量链脲佐菌素腹腔注射建立糖尿病大鼠模型，并将模型大鼠随机分为模型对照组、罗格列酮组和黄金胶囊组。大鼠造模成功2周后，罗格列酮组和黄金胶囊组分别灌胃罗格列酮(0.36 μg/g)和黄金胶囊(2.025 g/kg)，空白对照组和模型对照组灌胃生理盐水(1 μL/g)，1 d 1次，连续10周。检测空腹血糖及餐后2 h血糖；同时解剖大鼠取肝组织，行HE染色观察大鼠肝脏病理组织变化，免疫组化染色观察大鼠PI-3K和GLUT4 蛋白表达。结果：①与模型对照组对比，黄金胶囊组与罗格列酮组可降低糖尿病大鼠的血糖水平；与罗格列酮组对比，黄金胶囊组降糖效果较弱，差别均有统计学意义(P<0.05)；②肝脏组织中PI-3K、GLUT4蛋白表达，空白对照组与其他各组对比，模型对照组呈现低表达，表达强度低于罗格列酮组和黄金胶囊组；罗格列酮组与黄金胶囊组对比，前者表达强度更强，差别均有统计学意义(P<0.05)。结论：黄金胶囊可提高肝细胞PI-3K和GLUT4 的蛋白表达。

关键词黄金胶囊；糖尿病大鼠模型；磷脂酰肌醇3激酶；葡萄糖转运子4；胰岛素抵抗；动物；大鼠

现代医学认为，胰岛素通过信号转导调节糖代谢和能量代谢。其中磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI-3K) 途径被认为是胰岛素信号转导的经典途径[1]，是胰岛素在靶器官中信号转导的主要通路之一。胰岛素作用的靶器官在摄取、利用葡萄糖时是经一步一步蛋白结合、信号激活传导下去的，即从胰岛素受体(InsR)到胰岛素受体底物-1(IRS-1)，再到PI-3K，最后传递至葡萄糖转运因子4( glucose transporter 4,GLUT4)等一系列的信号转导过程完成的[2]，从而来调节肝细胞、肌细胞以及脂肪细胞对葡萄糖的摄取与利用[3]。这些信号转导过程的任何环节发生障碍，均可能诱导胰岛素抵抗的发生。黄金胶囊为甘肃中医药大学内部制剂，主要成分为黄连、鸡内金，组方基于中医学的解毒化浊法，取黄连清热燥湿、泻火解毒，鸡内金运脾消食、护胃和中以达到解毒化浊的作用，自2006年被用于临床以来，显示出良好的降血糖作用。既往研究[4-5]证明，大剂量黄金胶囊可明显改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的作用。本实验是在此基础上，进一步研究黄金胶囊改善胰岛素抵抗的分子机制。

1材料与方法

1.1动物

SPF级雄性Wistar大鼠48只，4月龄，体质量(200±20)g，由甘肃中医学院动物实验中心提供，动物质量合格证号：SCXK(甘) 2011-0001-0001365。

1.2药品、试剂与仪器

黄金胶囊由黄连、鸡内金组成，每粒胶囊4.5 g,含生药量约4.0 g，由甘肃中医药大学附属医院制剂科提供，批号1201101；罗格列酮，太极集团重庆涪陵制药厂有限公司产品，批号13010006。链脲佐菌素(streptozotoin，STZ)，美国Sigma公司提供，批号S0130-1G。PIK3CA免疫组化染色试剂盒(批号11CM231)、GLUT4免疫组化染色试剂盒(批号BA1351-1),均为武汉博士德生物工程有限公司产品；二抗，山羊抗兔免疫组化试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司，批号14188A03；免疫组化试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司提供，批号11CM251。Image-Pro Plus专业图像分析软件，美国Media Cybemetics公司产品；BI-2000医学图像分析系统分析图像，成都泰盟科技有限公司产品；强生血糖仪，美国强生中国医疗器材有限公司产品。

1.3模型的建立、动物分组与给药

参照Leng等[6]方法造模。设空白对照组12只,喂普通饲料；造模组36只，喂高脂饲料。4 w后，禁食12 h，将STZ按50 μg/g腹腔注射， 72 h后，禁食、不禁水12 h，尾静脉采血，测量大鼠空腹血糖(FPG)、 口服葡萄糖耐量试验(OGTT)后2 h血糖。取FPG≥11.0 mmol/L、OGTT 2h≥16.7 mmol/L的大鼠归入糖尿病模型对照组。将糖尿病模型大鼠随机分为模型对照组、罗格列酮组和黄金胶囊组。大鼠造模成功2周后，罗格列酮组和黄金胶囊组分别灌胃罗格列酮(0.36 μg/g)和黄金胶囊(2.025 g/kg)，空白对照组和模型对照组灌胃生理盐水(1 μL/g)，1 d 1次，连续10周。

1.4检测指标

1.4.1FBG、OGTT 2h

灌胃10周后，采血，检测FBG、OGTT 2h水平。

1.4.2肝脏组织病理学情况

取肝组织(肝左、右叶各一块)，大小约2 mm×15 mm×10 mm；放于对应编号的广口瓶中，加入40 g/L 多聚甲醛溶液固定24 h；常规石蜡包埋、切片(5 μm)；行HE染色，分别用10，40倍镜头电镜下观察HE染色及免疫组化染色。

1.4.3肝组织PI3K 、GLUT4蛋白表达

将染好的免疫组化标本片采用BI-2000医学图像分析系统分析图像，测定GLUT4、PI3K平均光密度。

1.5统计学方法

2结果

2.1各组大鼠FBG、OGTT 2 h水平对比

各组治疗前后对比，除空白对照组前后差别无统计学意义外，其余各组均有统计学意义。治疗前，除空白对照组外，其余各组大鼠血糖间对比，差别均无统计学意义。治疗后，与模型对照组对比，黄金胶囊组及罗格列酮组FBG、OGTT2h水平均降低，差别有统计学意义(P<0.05)；黄金胶囊组与罗格列酮组对比，后者降糖效果明显，差别有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1各组大鼠FBG、OGTT 2 h水平对比

注：与模型对照组治疗后对比，*P<0.05；与黄金胶囊组治疗后对比，#P<0.05。

2.2各组大鼠肝组织病理学情况对比

空白对照组大鼠肝细胞排列规则，质地均匀，可见成行排列的肝索细胞。模型对照组大鼠肝细胞排列不规则，质地不均匀，肝细胞内存在大小不等的脂滴。罗格列酮组大鼠肝细胞排列较规则，密度欠均匀，肝细胞内有大小不等的脂滴。黄金胶囊组大鼠肝细胞形态较规则，密度欠均匀，仍可见散在的大小不等的脂滴。见图1。

2.3各组大鼠肝组织PI3K 、GLUT4蛋白表达对比

2.3.1各组PI3K蛋白表达情况

空白对照组大鼠肝组织中棕色区域提示PI3K阳性，阳性显色细胞均为肝细胞，在肝细胞内棕色物均匀分布在细胞质及细胞膜上，其他细胞和肝细胞核内未见棕色阳性染色。模型对照组中目标蛋白主要分布在细胞膜及细胞质内，病变肝细胞中的脂滴内未见PI3K阳性染色，坏死肝细胞及炎性细胞内显色为阴性，阳性染色细胞多集中在中央静脉周围，相同视野内阳性显色面积较正常肝组织明显减少。罗格列酮组阳性表达位置不变，分布以中央静脉肝索周围多见，相同视野内阳性显色细胞分布不均匀，阳性表达较低于空白对照组，高于模型对照组。黄金胶囊组阳性表达特点同罗格列酮组，但阳性表达细胞数量及表达强度低于罗格列酮组，高于模型对照组。见图2。

2.3.2PI3K阳性表达图像分析

通过对切片图像学分析，对平均光密度进行比较得出：与其他各组对比，空白对照组PI3K蛋白表达最强最明显，差别有统计学意义(P<0.05)。模型对照组呈现低表达，表达强度低于罗格列酮组和黄金胶囊组，差别有统计学意义(P<0.05)。罗格列酮组与黄金胶囊组对比，前者表达强度更强，差别有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3各组大鼠肝组织PI3K蛋白表达

注：与空白对照组对比，*P<0.05；与模型对照组对比，#P<0.05；与黄金胶囊组对比，ΔP<0.05。

2.3.3各组GLUT4蛋白表达情况

各组表达结果同PI3K表达结果位置特点均相同,表达强度与PI3K表达强度相同。见图3。

2.3.4GLUT4阳性表达图像分析

通过对切片图像学分析，对平均光密度进行比较得出：与其他各组对比，空白对照组GLUT4蛋白表达最强最明显，差别有统计学意义(P<0.05)。模型对照组呈现低表达，表达强度低于罗格列酮组和黄金胶囊组，差别有统计学意义(P<0.05)。罗格列酮组与黄金胶囊组对比，前者表达强度强，差别有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4各组大鼠肝组织GLUT4蛋白表达

注：与空白对照组对比，*P<0.05；与模型对照组对比，#P<0.05；与黄金胶囊组对比，ΔP<0.05。

3讨论

黄金胶囊由黄连、鸡内金组成。黄连苦寒，归心、脾、胃、胆、大肠经，功效清热燥湿、泻火解毒。黄连治疗消渴首见于《名医别录》：“主五脏冷热，久下泄脓血，止消渴……”。《本草经百种录》云: “凡药能去湿者必增热，能除热者，必不能去湿，惟黄连能以苦燥湿，以寒除热，一举两得，莫神于此。”《本草正义》载:“黄连大苦大寒，苦燥湿，寒胜热，能泄降一切有余之湿火，而心、脾、肝、肾之热，胆、胃、大小肠之火，无不治之。”黄连中的主要成分为小檗碱，其有改善胰岛素抵抗、刺激胰岛素分泌和降低血脂的作用；可以增加肝脏中过氧化物酶增殖体激活受体，并可上调肝脏胰岛素诱导基因。还有研究表明：黄连中所含的生物碱可提高大鼠骨骼肌糖原储存；增加糖尿病大鼠胰岛素底物、葡萄糖转运蛋白4，从而起到降低血糖的作用[7-9]。

中医学认为：在疾病发生、发展过程中，气、血、津液运化失常，致水、湿、浊、痰、瘀等病理产物不断积聚、凝结，产生具有毒害机体的产物，均可称其为浊毒。浊毒既是一种对人体造成严重损害的致病因素，又是一种病理产物。浊毒互结，气机不畅，痰浊胶着，毒不能散，血行受阻，长此以往，化生痰、浊、瘀血，耗伤脏腑气血津液，从而造成浊毒内滞、脉络痹阻、脾不升清、阴虚内热的证机变化。痰湿的发病原因是由脾虚不能疏散水液，使水液聚集而成；而痰湿又可引起脾虚。脾虚湿盛日久，会导致阴虚湿痰瘀互结为患。脾虚日久积而生燥热、热又促进血瘀。痰湿热为痰湿病机之演变。胰岛素抵抗实质是湿、浊、毒等邪气的聚积，由于患者脾弱而不能发挥其升清降浊、运输水谷的作用，而发生脉道受阻，瘀血内生而化生为血浊。因此，血瘀、血浊与胰岛素抵抗息息相关。黄连具有清热燥湿、泻火解毒的作用，鸡内金有消积化浊、健运脾胃的作用，二药配伍，可达到解毒化浊、调气活血的效果。

本研究表明：黄金胶囊具有降低DM大鼠模型空腹及餐后血糖的作用，可增加肝脏组织胰岛素信号传导通路中PI-3K和GLUT4蛋白的表达。此为中医药治疗糖尿病胰岛素抵抗奠定了基础。

4参考文献

[1]Taha C, Klip A.The insulin signaling pathway[J].J Membr Bio,1999,169(1):1-1.

[2]Wojtaszewski JF, Hansen BF, Kiens B, et al.Insulin signaling in human skeletal muscle:time course and effect of exercise[J].Diabetes,1997,46(11):1775-1781.

[3]姚洁，盛树力，闵嵘，等.APP17肽对D-半乳糖老化小鼠海马神经元IRS和PI3K表达的影响[J].中国药理学通报，2007，23(1):95-99.

[4]崔庆荣, 安小平, 康学东, 等.黄金胶囊改善2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠胰岛素感性研究[J].中国实验方剂学杂志, 2010, 16(5):150-152.

[5]余臣祖, 安小平, 康学东, 等.黄金胶囊对2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的影响[J].中国实验方剂学杂志, 2011, 17(3):199-201.

[6]Leng SH, Lu FE, Xu LJ.Therapeutic effects of berberine in impaired glucose tolerance rats and its influence on insulin secretion[J].Acta Pharmacol Sin, 2004, 25(4):496-502.

[7]徐颖.黄连总生物碱的提取及其对实验性糖尿病肾病大鼠的保护作用及机制的初步研究[D].重庆：第三军医大学，2006:36.

[8]徐颖，周世文，汤建林，等.黄连总生物碱对实验性糖尿病肾病大鼠肾功能保护作用的研究[J].重庆医学，2006,36(6):526.

[9]应懿.黄连生物碱的提取及其对实验性糖尿病周围神经病变和糖尿病肌病的保护作用及机制研究[D].重庆：第三军医大学，2007:27.

(编辑陶珠)

文章编号:1001-6910(2016)01-0050-05

中图分类号:R587.1

文献标志码:B

doi:10.3969/j.issn.1001-6910.2016.01.24

作者简介

康学东(1962-)，男(汉族)，甘肃兰州人，主任医师，研究方向：中西医结合治疗糖尿病及其并发症。

通信作者：张瀚文，硕士研究生，653989343@qq.com

* 基金项目：2012年甘肃省科技厅科技计划项目(1208RJZA179)

收稿日期：2014-12-08；修回日期：2015-11-17