NO前体药物JS-K体外对乙肝病毒HBsAg和HBeAg的影响



NO前体药物JS-K体外对乙肝病毒HBsAg和HBeAg的影响

王欢1,2，周艳萌2，勾英2，刘正芸3，惠景1，刘杰3

(遵义医学院1. 医学与生物学研究中心； 2. 微生物学教研室；3.基础药理省部共建教育部重点实验室，贵州 遵义563099)

[摘要]目的 观察一氧化氮前体药物JS-K体外对乙肝病毒HBsAg和HBeAg的影响。方法 以携带有HBV基因组的HepG2.2.15细胞作为研究工具，MTT法检测JS-K(0、1、2、5、10 μM)对细胞的毒性作用；荧光染色检测JS-K作用于细胞后一氧化氮的释放情况；ELISA及免疫荧光结合激光共聚焦显微镜检测的方法，检测不同浓度JS-K对细胞中HBsAg和HBeAg表达的影响。结果 包括最高浓度组(10 μM)在内的各浓度JS-K对细胞均无统计学意义(P> 0.05)；JS-K作用于细胞24 h后，细胞内一氧化氮的释放明显增多；随着JS-K浓度的增高，HBsAg的表达明显降低，HBeAg的表达有一定的减少。结论 一氧化氮前体药物JS-K在体外对乙肝病毒的抗原有一定的抑制作用。

[关键词]一氧化氮；JS-K；乙型肝炎病毒

目前乙肝的抗病毒治疗药物主要有干扰素和核苷类似物[1]，这些治疗方法主要是通过抑制病毒复制中的关键酶类而干预病毒复制过程，或者针对宿主抗病毒的不同环节而发挥抗病毒作用。这些药物虽有一定的疗效，但也存在病毒不易被完全清除、停药后反跳等不良反应，而且针对核苷类似物的耐药性也逐渐增加。因此，新型抗乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)药物的研究具有重要意义。一氧化氮(nitric oxide, NO)主要是由L-精氨酸在一氧化氮合酶(NOS)的催化下产生的一种气态自由基，具有维持血管张力的恒定、调节血压稳定及脑血流、促进记忆过程、杀伤细菌病毒及肿瘤细胞等多种生物学功能。JS-K是一种具有特定靶向性的偶氮鎓二醇盐类NO供体药物[2](也称前体药物)，它能在谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)作用下释放定量的NO。为了寻找新型抗HBV药物，因此我们以HepG2.2.15细胞作为工具，对JS-K的抗HBV活性进行了评价，现报告如下。

1材料与方法

1.1实验材料细胞：HepG2.2.15细胞购于湘雅医学院，由本室保存。主要试剂：JS-K由Dr. Keefer (NCI at Frederick)教授惠赠；DMEM培养基以及进口胎牛血清购于Hyclone公司；MTT、DAF-FM DA(一氧化氮荧光探针)以及DAPI购于碧云天生物技术公司；HBsAg和HBeAg的ELISA检测试剂盒均为中山大学达安基因股份有限公司产品；HBsAg及HBeAg抗体购于博奥森生物技术公司。

1.2实验方法

1.2.1JS-K对HepG2.2.15细胞的毒性实验将对数生长期的HepG2.2.15细胞消化后接种于96孔板中，细胞浓度为5×103个/100 μL/孔；次日待细胞贴壁后，分别加入不同浓度的JS-K，每组设6个平行孔，然后将板置于37 ℃，5% CO2孵箱中培养。72 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，继续培养4 h，弃去孔中液体，加入DMSO，100 μL/孔，轻轻摇晃，使其结晶物充分溶解，用全自动酶标仪检测OD490的值，并按下述公式计算细胞存活率。

细胞存活率=实验组平均 OD 值/对照组平均 OD值

1.2.2NO检测将HepG2.2.15细胞接种于petri皿中，次日待细胞贴壁后加入终浓度为10 μM的JS-K，作用24 h后用于NO的检测。按照说明书，用DAF-FM DA稀释液稀释DAF-FM DA，至终浓度为5 μM。弃去皿中的培养液，加入500 μL稀释后的DAF-FM DA，置37 ℃培养箱中孵育20 min，PBS洗3次，以除去未进入细胞内的DAF-FM DA。将皿置于激光共聚焦显微镜下(激发波长：495 nm，发射波长：515 nm)检测荧光的情况。

1.2.3ELISA法检测HBsAg和HBeAg不同浓度的JS-K作用于HepG2.2.15细胞72 h后收集各组上清用于HBsAg和HBeAg的检测，具体检测步骤按照试剂盒说明书进行，最后在波长450 nm下检测各组吸光度。

1.2.4免疫荧光法检测HBsAg和HBeAg的表达用4%多聚甲醛对JS-K作用后的HepG2.2.15细胞在室温下固定10 min，PBS清洗3次。0.1% Triton X-100作用10 min，PBS清洗3次；封闭液室温孵育30 min后，加入适量稀释后的一抗，置于湿盒中4 ℃过夜，PBS清洗3次；避光滴加荧光素标记的二抗，置于湿盒中室温1 h，PBS清洗3次；DAPI复染细胞核，PBS清洗3次，封片，激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

2结果

2.1JS-K对HepG2.2.15细胞的毒性作用由图1可见，与对照组比较，各浓度组的细胞存活率无统计学意义(P>0.05)，提示JS-K在浓度10μM以内对HepG2.2.15细胞无明显毒性作用。

图1　JS-K对HepG2.2.15细胞生长的影响

2.2JS-K对NO水平的影响用特异性荧光探针DAF-FM DA标记细胞内的NO后，对照组细胞具有较弱的绿色荧光，即胞内NO水平较低，10μM的JS-K作用24 h后细胞内的荧光信号明显高于对照组，提示作为NO前体的JS-K作用于细胞后，导致细胞内NO水平明显升高(见图2)。

2.3JS-K对HepG2.2.15细胞HBsAg表达的影响不同浓度的JS-K作用于HepG2.2.15细胞72h后，用ELISA法检测培养上清中HBsAg的表达情况，结果显示：随着JS-K浓度的增高，HBsAg的表达明显降低，当JS-K浓度达到10μM时，HBsAg的表达量降低了70%以上(见图3)；同时，通过免疫荧光，利用激光共聚焦显微镜检测显示HBsAg(绿色荧光)主要表达在胞浆，JS-K作用后HBsAg明显减弱(见图3)，提示JS-K有非常显著的抑制HBsAg的作用。

A:对照组；B：JS-K组。图2　JS-K对NO表达的影响(×630)

A:对照组；B：JS-K组；各浓度组与对照组比较，* P<0.05，** P<0.01。图3　JS-K对HepG2.2.15细胞HBsAg表达的影响

2.4JS-K对HepG2.2.15细胞HBeAg表达的影响不同浓度的JS-K作用于HepG2.2.15细胞72h后，用ELISA检测细胞上清中HBeAg的表达情况。结果显示：随着JS-K浓度的增高，HBeAg的表达明显降低，当JS-K浓度达到5μM时，HBeAg的表达量降低了30%左右，而随着用药浓度的进一步增高(>5μM)，HBeAg的表达并未继续降低，而是基本维持在与5μM时的相似水平(见图4)，提示JS-K在一定范围内具有抑制HBeAg表达的作用。同时，免疫荧光结果也显示，HBeAg(绿色荧光)在胞浆和胞核中都有表达，但大多集中在胞浆中近胞核处，JS-K作用后，HBeAg的表达有一定减弱(见图4)。

A:对照组；B：JS-K组；各浓度组与对照组比较，* P<0.05，** P<0.01。图4　JS-K对HepG2.2.15细胞HBeAg表达的影响

3讨论

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)相关性疾病已成为当今威胁人类健康的主要疾病之一。目前针对乙肝的抗病毒治疗药物主要有核苷类似物及干扰素。这些药物虽有一定疗效，但也存在不良反应，而且针对核苷类似物的耐药性也逐渐增加。因此，新型抗HBV药物的研究具有更重要的意义。

NO在体内主要是由L-精氨酸在一氧化氮合酶(NOS)的催化下产生的一种气态自由基，具有维持血管张力的恒定、调节血压稳定及脑血流、促进记忆过程、杀伤细菌病毒及肿瘤细胞等多种生物学功能。早在十多年前Reiss CS等[3]就总结了NO能够抑制多种病毒的复制，包括：脊髓灰质炎病毒、小鼠肝炎病毒、流感病毒、水疱性口炎病毒、单纯疱疹病毒(Ⅰ型)、EB病毒、获得性免疫缺陷病毒(HIV)以及HBV等等。

JS-K作为NO供体药物，它能在谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)作用下释放定量的NO，以在肿瘤细胞中过度表达的GSTs为靶点，与GSTs结合，抑制GSTs的活性，在靶细胞中释放NO而发挥杀细胞效应，因此目前其研究主要集中于抗肿瘤方面，如：肝癌细胞、结肠癌细胞、白血病细胞、前列腺癌细胞、乳腺癌细胞以及肺癌细胞等[4-13]。对于肿瘤细胞，JS-K主要产生两方面的作用：一方面释放NO，直接杀灭肿瘤细胞；另一方面，JS-K在细胞内耗竭GSH与GST，从而削弱细胞对化疗药物的外排作用。

有关JS-K在病毒性疾病中的研究尚未见报道。本研究首次发现了JS-K有潜在抗HBV的作用：它能在细胞中产生NO，引起HBsAg和HBeAg的分泌减少，尤其是对HBsAg的抑制。现有研究认为NO抑制病毒复制的机制主要集中于：一方面NO能够影响含铁和巯基的蛋白的功能，如：鸟苷酸环化酶、核苷酸还原酶、顺乌头酸酶和线粒体电子传递酶等[14]，使酶活性受到抑制，从而阻断了细胞内能量和DNA的合成，引起细胞毒性效应，抑制病毒增殖；另一方面，NO能与超氧阴离子(O2-)作用生成具有强氧化作用的过氧化亚硝基阴离子ONOO-，它能氧化酶与蛋白质等，使之硝基化并灭活酶活性，造成细胞代谢紊乱。

因此，从本研究结果看来，可推测JS-K抗HBV的效应可能与JS-K和细胞内GST结合后释放NO有着重要关系，但释放的NO抑制HBV相关抗原分泌的机制究竟是使病毒的RNA、DNA以及蛋白质的合成受到抑制，还是使病毒的结构蛋白被硝基化，又或者是其他什么原因，值得进一步研究。

[参考文献]

[1] Kwon H, Lok A S. Hepatitis B therapy [J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2011, 8(5): 275-284.

[2] Edes K, Cassidy P, Shami P J, et al. JS-K, a nitric oxide prodrug, has enhanced cytotoxicity in colon cancer cells with knockdown of thioredoxin reductase 1 [J]. PLoS One，2010, 5(1): e8786.

[3] Reiss C S, Komatsu T. Does nitric oxide play a critical role in viral infections [J]? J Virol，1998,72(6): 4547-4551.

[4] Ren Z, Kar S, Wang Z, et al. JS-K, a novel non-ionic diazeniumdiolate derivative, inhibits Hep3B hepatoma cell growth and induces c-Jun phosphorylation via multiple MAP kinase pathways [J]. J Cell Physiol，2003, 197(3): 426-434.

[5] Edes K, Cassidy P, Shami P J, et al. JS-K, a nitric oxide prodrug, has enhanced cytotoxicity in colon cancer cells with knockdown of thioredoxin reductase 1 [J]. PLoS One，2010, 5(1):e8786.

[6] Liu J, Malavya S, Wang X, et al. Gene expression profiling for nitric oxide prodrug JS-K to kill HL-60 myeloid leukemia cells [J]. Genomics，2009, 94(1): 32-38.

[7] Laschak M, Spindler K D, Schrader A J, et al. JS-K, a glutathione/glutathioneS-transferase-activated nitric oxide releasing prodrug inhibits androgen receptor and WNT-signaling in prostate cancer cells [J]. BMC Cancer，2012, 12:130.

[8] McMurtry V, Saavedra J E, Nieves-Alicea R,et al.JS-K, a nitric oxide-releasing prodrug, induces breast cancer cell death while sparing normal mammary epithelial cells [J]. Int J Oncol，2011, 38(4): 963-971.

[9] Maciag A E, Chakrapani H, Saavedra J E, et al. The nitric oxide prodrug JS-K is effective against non-small-cell lung cancer cells in vitro and in vivo: involvement of reactive oxygen species [J]. J Pharmacol Exp Ther，2011, 336(2):313-320.

[10] 范振海, 匡菊香, 徐尚福, 等. NO前药JS-K对HL-60细胞增殖、分化的影响[J]. 中国药理学通报，2009, 25(6): 797-800.

[11] Fionda C, Abruzzese M P, Zingoni A,et al. Nitric oxide donors increase PVR/CD155 DNAM-1 ligand expression in multiple myeloma cells: role of DNA damage response activation [J]. BMC Cancer，2015, 15: 17.

[12] Kaczmarek M Z, Holland R J, Lavanier S A, et al. Mechanism of action for the cytotoxic effects of the nitric oxide prodrug JS-K in murine erythroleukemia cells [J]. Leuk Res，2014, 38(3): 377-382.

[13] Maciag A E, Holland R J, Robert Cheng Y S, et al. Nitric oxide-releasing prodrug triggers cancer cell death through deregulation of cellular redox balance [J]. Redox Biol，2013, 1:115-124.

[14] Rimmelzwaan G F, Barrs MMJW, Lijster P D, et al. Inhibition of influenza virus replication by nitric oxide [J]. J Virol，1999, 73(10): 8880-8883.

[收稿2015-04-11;修回2015-05-27]

(编辑：谭秀荣)

基础医学研究

Experimental study of nitric oxide prodrug JS-K on inhibiting HBsAg and HBeAg in vitro

WangHuan1,2,ZhouYanmeng2,GouYing2,LiuZhengyun3,HuiJing1,LiuJie3

(1.Research Center for Medicine & Biology，Zunyi Guizhou 563099, China ;2.Department of Microbiology，Zunyi Guizhou 563099, China;3.Key Lab for Basic Pharmacology of Ministry of Education，Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099,China )

[Abstract]Objective To test the effect of nitric oxide prodrug JS-K in vitro against HBsAg and HBeAg. Methods HepG2.2.15 Cells with the HBV Gene were used to detect the cytotoxic effect of JS-K (0，1，2，5，10 μM) in killing HBV-containing cells.The release of NO after JS-K was determined by fluorescent staining; the expression of HBsAg and HBeAg was examined by ELISA and immunofluorescence combined with confocal laser scanning.Results Under the concentration of 10 μM, JS-K have no obvious toxic action on cells (P﹥0.05);When the concentration of JS-K was increased, the expression of HBsAg was decreased and the expression of HBeAg was also reduced.Conclusion Nitric oxide prodrug JS-K has the inhibitory activity on HBV antigen in vitro.

[Key words]nitric oxide;JS-K;hepatitis B virus

[文献标志码][中图法分类号] R575.1 A

[文章编号]1000-2715(2015)03-0226-04

[基金项目]国家自然科学基金资助项目(NO：81360261)；贵州省科学技术基金资助项目(NO：黔科合J字LKZ[2013]08)；遵义医学院博士启动基金资助项目(NO：F-578)。