大鼠双侧卵巢摘除术比较



大鼠双侧卵巢摘除术比较

刘波，刘佳云，李菲，龚其海

(遵义医学院 药理学教研室暨基础药理省部共建教育部重点实验室 ，贵州 遵义563099)

[摘要]目的 3种大鼠双侧卵巢摘除术的比较。方法 采用腹部切口法、背部切口法及腹股沟切口法摘除雌性大鼠双侧卵巢，通过手术所需时间、摘除双侧卵巢后动物死亡率及体重变化以比较3种大鼠双侧卵巢摘除术。结果 通过腹部切口完成手术所需时间为(9.75±1.58)min，背部切口所需时间为(9.00±1.46)min，腹股沟切口所需时间为(11.1±1.76)min，背部切口法所需时间明显少于腹股沟切口法(P<0.05)；3种方法术后均无死亡；术后前3 d，背部切口法体重下降较其他方法平稳；3种方法切除卵巢后阴道脱落细胞周期均消失，血清中雌激素水平较假手术组明显下降，卵泡刺激素变化没有统计学意义。结论 在3种大鼠双侧卵巢摘除术中，背部切口法操作简便易行，术后对动物体重影响小，值得推广应用。

[关键词]卵巢摘除术；体重；大鼠

双侧卵巢切除术(去势造模)被广泛应用于制备骨质疏松模型和其他去除雌激素影响的模型[1-2]。非人类的灵长类物种切除双侧卵巢后，出现类似于人类雌激素减少的现象如生殖周期的停止、骨密度降低和动脉硬化等，但由于价格高昂、数量有限等因素限制了这种动物的使用。而大鼠作为最常用的实验动物之一，被广泛应用于各种实验中，其中包括双侧卵巢切除术。目前切除大鼠双侧卵巢的方法有腹部切口法、背部切口法和腹股沟切口法[3]。这3种手术方法在以往的研究中均有采用[4-6]，然而这3种方法中哪一种方法安全性更好、操作更简便、对大鼠体重的影响更小、成模率如何，目前尚不清楚。因此，本研究对切除大鼠双侧卵巢的3种手术方法进行比较，旨在为挑选更优的大鼠双侧卵巢摘除术提供实验依据。

1材料与方法

1.1实验动物与材料SPF级雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠35只，体重230±20 g(购自第三军医大学大坪医院实验动物中心(许可证分别为:SCXK(渝)2012-0005)。手术固定板、手术剪、止血钳、手术镊、缝针、手术缝线、无菌纱布及棉球、手术孔巾、5 mL注射器、7% 水合氯醛、青霉素注射粉剂(80万)、卵泡刺激素及雌二醇ELISA试剂盒(美国RD 公司进口分装)、瑞氏染液和姬姆萨染液(北京索莱宝科技有限公司)、全自动多功能酶标仪(imark 通用酶标仪，美国Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1分组分为腹部切口组、背部切口组、腹股沟切口组、假手术组，前3组每组10只，假手术组5只。

1.2.2造模方法从打开腹腔开始计时，到切口缝合完毕截至。所有操作均由1个人完成。

腹部切口组：大鼠术前禁食12 h，采用7%水合氯醛 0.5 mL/100 g腹腔麻醉后，仰卧位固定。备皮，用碘酊消毒手术区，75%乙醇脱碘2次，铺手术孔巾，严格无菌状态下，沿腹白线切口打开腹腔，找到“Y”型子宫，沿每侧子宫找到粉红色绿豆大小的卵巢，在卵巢和子宫交接处结扎，彻底切除两侧卵巢，逐层缝合皮肤。局部碘酊消毒，肌注青霉素(20万单位/只)预防感染，监测大鼠死亡情况及术后1周的体重变化。

背部切口组：禁食、麻醉同上。俯卧位固定，剪去术区的鼠毛备皮，用碘酊消毒，75%乙醇脱碘2次，铺上手术孔巾，严格无菌状态下，在背部肋弓下行1 cm左右，脊柱侧面1 cm处切口，逐层切开，暴露腹腔。分离性腺周围的脂肪组织，找到卵巢，结扎卵巢周围血管，切除卵巢，然后逐层缝合，同法摘除另一侧卵巢。局部碘酊消毒，肌注青霉素。监测大鼠死亡情况及术后1周的体重变化。

腹股沟切口组：禁食、麻醉同上。仰卧位固定，于腹股沟中点切开1～1.5 cm切口，分离皮下组织和肌肉，打开盆腔，找到并切除卵巢，步骤同腹部切口法。

假手术组只从腹部正中打开腹腔，找到卵巢，但不切除。术后观察大鼠伤口开裂以及伤口感染的情况。

1.2.3阴道涂片观察 从术后2周开始每日同一时间段对各组大鼠进行阴道涂片观察。将大鼠固定，抖掉或擦净排泄物，用沾有生理盐水的小棉签从阴道口缓慢轻柔插入大鼠阴道并且缓慢转动，然后将棉签缓慢抽出。涂片，按照操作步骤进行瑞氏-姬姆萨染色，显微镜下观察有无细胞形状的变化周期[7]。

1.2.4激素测定 于术后4周测定血清中卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)、雌二醇(estradio, E2)激素水平。经腹主动脉采血3～5 mL，3 000 r/min离心10 min，取血清置于微量离心管中分别标号，-80 ℃冰箱保存。血清中雌激素、 FSH水平检测按照试剂盒说明书，采用酶联免疫法进行检测。

2结果

2.1手术耗时及死亡率从备皮开始计时，伤口缝合完毕结束。腹部切口组所需时间为9.75±1.58 min，腹股沟切口组所需时间为11.1±1.76 min，背部切口组所需时间为9.00±1.46 min(与腹股沟组相比，P<0.05)，背部切口组较其他两组手术时间明显减少(见图1)。3种方法切除卵巢后各组大鼠均无死亡、伤口均未开裂、无伤口感染。

经单因素方差分析，多组之间两两比较：与腹股沟切口组比较，*P<0.05。图1　3种方法摘除卵巢所需的时间

2.2卵巢摘除术后大鼠体重的变化与假手术相比，卵巢切除后第3天大鼠体重均略有下降，随后开始稳步上升，背部切口组在术后3 d体重下降趋势不明显(见图2)。

图2　卵巢摘除术后大鼠体重的变化±s, n=5)

2.3血清雌激素及卵泡雌激素水平的变化与空白对照组相比，3种方法切除卵巢后大鼠均未出现动情期，且雌激素均明显下降(与假手术组相比，P<0.05)，而卵泡刺激素水平无明显差异(见表1)。

2.4阴道细胞形状的周期变化通过细胞涂片观

察阴道细胞形状的周期变化(见图3)。阴道分泌物中有大量的有核上皮细胞，椭圆形，核深染 (见图3A)； 动情期:有大量的无核的角化上皮细胞，落叶状堆积(见图3B)； 动情后期：白细胞开始增多，可见有核上皮细胞(见图3C)； 动情间期: 动情后期阴道涂片，有比例相当的角化上皮细胞、有核上皮细胞和白细胞(见图3D)[7]。

组别出现动情期动物数雌激素水平(ng/L)卵泡刺激素水平(IU/L)假手术组5269.8±22.567.28±3.28腹部切口组0132.2±24.7*9.80±3.69背部切口组0143.1±21.0*8.82±1.29腹股沟切口组0141.8±18.1*8.78±2.49

经单因素方差分析，多组之间两两比较：与假手术比较，*P<0.05。

A：动情前期；B：动情期；C：动情后期；D：动情间期。图3　假手术组阴道涂片细胞形状周期变化(×400)

3讨论

为排除雌激素干扰，动物双侧卵巢切除模型应用广泛。卵巢切除后会引起一系列变化，如生殖周期停止、骨密度降低、动脉硬化、雌激素下降等。雌性大鼠去势模型的制备方法有经腹正中切口、经背部脊柱旁切口和经腹股沟切口。大鼠左侧卵巢位于腰大肌外侧缘，位置靠近背部，从背部开口容易找到卵巢。因腹部经常接触垫料，腹部开口法和腹股沟切口法的感染几率比较大。此外，从腹部和腹股沟开口手术过程会碰到肠组织，术后容易造成肠粘连。并且切口需要2 cm左右才能顺利的找到双侧卵巢。大鼠清醒后挠抓切口，容易使手术切口裂开。背部伤口两侧切口感染几率相对较小，大鼠无法挠及背部伤口，且只需要0.5 cm大的切口便能顺利找到卵巢。研究结果表明背部切口法较其他2种方法，操作时间最少，术后体重变化不大。选择用背部切口法切除卵巢，可以减少造模所需时间和避免大鼠体重大幅度降低。

本实验还通过除瑞氏-姬姆萨染色，观察阴道脱落细胞有无动情周期出现。发现经3种方法切除卵巢后，大鼠的动情周期变化没有规律, 周期时相变化基本停止,没有明显的动情前期和动情期，说明模型均建立成功[8-9]。雌激素、FSH水平是作为判断卵巢切除成功的标志，本研究采用大鼠酶联免疫法试剂盒测定雌激素、FSH 水平变化情况，发现卵巢切除后雌激素水平明显低于假手术组，FSH则无明显变化,与沈洁、梁秀兰等测定结果一致[6,10]。说明3种方法均能成功建立模型。

经本研究比较，3种切除双侧卵巢的方法中，经背部切除双侧卵巢的方法，操作相对简便易行、术野暴露好、手术切口小、术后对动物体重影响小，大大减少了术后切口感染和腹腔粘连与疝出的机率，优于其他2种方法。同时，本研究也为同属动物如Wistar大鼠、小鼠等行双侧卵巢切除的方法提供参考。在单纯的去除双侧卵巢动物模型中，建议使用背部切除双侧卵巢的方法。

[参考文献]

[1] 冀瑞锋,韩树峰.骨质疏松造模及治疗[J].中外医疗,2013,32(35):197-198.

[2] Unsal F, Sönmez M F.The Effects of Ovariectomy on Ghrelin Expression in the Rat Uterus[J]. Adv Clin Exp Med, 2014,23(3):363-370.

[3] 李长天，王雅莉，陈雁飞.葛根素对去卵巢大鼠体重及大脑海马CA1区、CA3区神经元形态的影响[J].中国老年学杂志,2012,10(32):4426-4428.

[4] 杨非柯,刘竟芳, 陈 伟, 等.17-β-雌二醇对去卵巢胰岛素抵抗大鼠骨骼肌中葡萄糖转运体4表达的影响[J].中国老年学杂志,2014,1(34):136-139.

[5] 黄惠娟,郑小花,李宝恒.橄榄油对大鼠去势后骨代谢指标及骨密度的影响[J].实验与基础研究,2013,20(28):3333-3336.

[6] 梁秀兰, 阮祥燕, 蒋辉.SD大鼠绝经模型建立的研究[J].医学综述,2010,16(9):1414-1416.

[7] 刘晓宇,王娇,钱欣,等.围绝经期大鼠动情周期变化的研究[J]. 哈尔滨医科大学学报,2014,48(5):358-360.

[8] Suzuki O, Koura M, Noguchi Y,et al. Optimization of sup erovulation induction by human menopausal gonadotrop in inguinea pigs based on follicular waves and FSH-receptor homologies [J] . Mol Reprod Dev,2003,64(2):219-225.

[9] 英永,李莉,王韶艳.几种常规染色方法在大鼠阴道涂片中的应用[J].上海畜牧兽医通讯,2010,4:28-29.

[10] 沈洁, 沈梅红, 李忠仁. 电针对去势大鼠雌激素及子宫内膜影响的研究[J]. 江西中医学院学报, 2009, 21(2):47-48.

[收稿2015-03-12;修回2015-04-07]

(编辑：谭秀荣)

Comparison of methods of bilateral ovariectomy in rats

LiuBo,LiuJiayun,LiFei,GongQihai

(Department of Pharmacology and The Key Laboratory of Basic Pharmcology of Guizhou Province,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

[Abstract]Objective To Compare three different methods of bilateral ovariectomy in rats.Methods The bilateral ovaries of female rats were removed through abdominal incision, back and groin incision. The time required in this surgery, the mortality, and the weight of the animals were used to compare three methods.Results The period of ovariectomy using abdominal incision were 9.75 + 1.58 min, the time in back incision group were 9.00 + 1.46 min, groin incision group were 11.1 + 1.76 min. The time required in back incision group was significantly less than that in groin incisions group (P<0.05). There was no postoperative death in the three groups. After three days, the weight reduction of groin incision group was mild. The ovarian cycle of vaginal exfoliated cells in three groups were disappearing after ovariectomy, serum estrogen was significantly decreased compared with control group. However, follicle-stimulating hormone showed no significant difference between normal and bilateral ovariectomy groups.Conclusion Among the three method of ovariectomy, the method by back incision is simple; the weight reduction is less in back incision group. So, the method of back incision is worthy of popularization and application.

[Key words]ovariectomy; weight; rat

[文献标志码][中图法分类号] R713.6 A

[文章编号]1000-2715(2015)03-0251-04

[基金项目]国家自然科学基金资助项目(NO：81060349)；贵州省科技厅社会攻关计划(NO：黔科合SY字20083040)；贵州省自然科学基金重点项目(NO：黔科合JZ字20142015)。[通信作者]龚其海，男，博士，教授，硕士生导师，研究方向：神经药理学，E-mail:gqh@zmc.edu.cn。