淫羊藿素对淀粉样蛋白25-35片段所致大鼠胆碱能神经元损伤的保护作用



淫羊藿素对淀粉样蛋白25-35片段所致大鼠胆碱能神经元损伤的保护作用

冯飞，陈乾，宋斌，熊德庆，罗勇

(遵义医学院第三附属医院 神经内科，贵州 遵义563003)

[摘要]目的 探索淫羊藿素(ICT)对淀粉样蛋白25-35片段(Aβ25-35)所致胆碱能神经元损伤的保护作用。方法 40只18月龄SD大鼠随机均分为对照组、模型组、ICT低剂量组(20 mg/kg)、ICT中剂量组(40 mg/kg)、ICT高剂量组(80 mg/kg)，模型及ICT治疗组应用ICT灌胃预处理3 d后，在大鼠鼠脑海马内注入Aβ25-35造模，ICT继续灌胃2周后，水迷宫观察各组大鼠学习记忆能力， ELISA检测大鼠海马内乙酰胆碱酯酶(AchE)和胆碱乙酰化酶(ChAT)的含量。结果 模型组大鼠较对照组大鼠出现明显学习记忆功能减退，且海马组织中AchE和ChAT含量较对照组明显下降。然而，ICT各剂量治疗组较模型组大鼠学习记忆功能减退明显改善，且AchE和ChAT含量显著增加。结论 ICT可通过改善脑内胆碱能神经功能减轻Aβ25-35所致的大鼠学习记忆功能减退。

[关键词]阿尔茨海默病； 淫羊藿素；胆碱乙酰化酶；胆碱酯酶

痴呆主要表现为获得性高级功能的全面障碍，具有发病率高、致残率高、病死率高等特点。其中，阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)是老年期痴呆的最常见类型。大脑内乙酰胆碱系统对于记忆学习功能的形成和维持至关重要，现临床治疗痴呆仍多选用乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AchE)抑制剂，如他克林、多奈哌齐等。但上述药物均只能改善症状或延缓疾病进程，且价格昂贵，不良反应多，临床应用受限。因此，继续探索新的AD治疗药物具有重要意义。淫羊藿素(icartin，ICT)和淫羊藿苷均是淫羊藿中提取出的有效成分，属于黄酮类化合物。我们前期研究证实淫羊藿苷对多种AD模型大鼠具有防治作用[1-2]。ICT是淫羊藿苷在机体内的主要代谢产物之一[3]，分子结构明显小于淫羊藿苷，含多酚羟基的化学结构，具有清除自由基、抗炎、免疫抑制、延缓衰老及神经保护等作用[4-6]。但ICT是否可改善淀粉样蛋白所致的大鼠学习记忆减退及对大鼠脑内胆碱能系统有何影响尚不清楚。

1材料与方法

1.1实验动物、主要试剂及仪器实验动物：SPF级雄性SD 大鼠，质量(200±20) g，由重庆第三军医大学提供[许可证号: scxk (渝) 2012-0005]。颗粒饲料饲养，光照时间12/12 h,室温22～23 ℃。ICT购买于南京泽朗医药科技有限公司，用HPLC 法检测纯度为98.3 %。用蒸馏水配置成不同浓度备用。淀粉样蛋白25～35片段(25～35 fragment of beta-amyloid, Aβ25-35)购至上海强耀生物科技有限公司，用无菌生理盐水(normal saline, NS)稀释成5 g/L，37 ℃孵育1周，使其变为聚集态的Aβ25-35。胆碱乙酰化酶(cholineacetylase, ChAT)、AchE的 ELISA检测试剂盒购自上海齐一生物科技有限公司。江湾Ⅱ型脑立体定位仪：上海第二精密仪器厂产品。Morris水迷宫: 成都泰盟科技有限公司产品。

1.2动物分组及造模将40只18月龄SD大鼠随机分为对照组、模型组、ICT低剂量组(20 mg/kg)ICT中剂量组(40 mg/kg)和ICT高剂量组(80 mg/kg)，每组8只。模型和ICT各组大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3 mL/100 g)，然后固定于大鼠脑立体定位仪上，向右侧海马区进针，坐标为：AP-4 mm(前囟后)，MR-2.8 mm(中线右侧)，H-3 mm(自脑膜起的深度)。定位后钻开颅骨，微量注射器垂直进针3 mm，以0.2 uL/min的速度缓慢注入2 μL Aβ25-35(10μg)，留针5 min，对照组在相应脑区注入等体积生理盐水。ICT各组于造模前3 d开始灌胃，持续至造模后2周[7]，正常组和模型组灌胃等体积蒸馏水，给药时间固定在上午9～ 11时，每日1次。

参考文献1.3Morris水迷宫实验实验予以定向航行实验[8]，各组小鼠制模后给药第9 ～13天进行Morris水迷宫训练，每天上下午各1次，取2次平均值为每天的成绩以评价其学习和记忆能力。第14天给药1 h后采用Morris水迷宫进行行为学检测，检测大鼠找到安全岛的时间为逃避潜伏期，游泳路径长度为搜索距离。

1.4ELISA检测大鼠海马区ACh E和ChAT的含量第14天Morris水迷宫实验结束后，将各组大鼠用10%水合氯醛( 0.3 mL /100 g) 腹腔注射麻醉，然后迅速取出脑组织，用预冷的生理盐水冲洗表面血液，用滤纸吸干，去除软脑膜和血管，分离出海马组织，加生理盐水制成10% 的组织匀浆，以3 500 r/min的速度离心10 min，取上清液，参照试剂盒说明书用ELISA 法测定AchE和ChAT 含量。

2结果

2.1ICT对Aβ25-35所致大鼠学习记忆减退的影响Aβ25-35造模后，与对照组相比，模型组大鼠表现出明显的学习记忆功能下降。经ICT(20～80 mg)治疗后，大鼠在治疗后的逃避潜伏期(见表1)及搜索距离(见表2)较模型大鼠明显缩短，提示ICT可减轻Aβ25-35所致大鼠学习记忆减退。

组别逃避潜伏期(s)d10d11d12d13d14对照组21.6±10.217.5±8.014.4±6.312.6±3.113.6±4.2模型组44.6±27.0*34.7±20.6*27.9±10.6*22.9±8.3*19.2±5.1*ICT20mg/kg38.5±20.427.7±12.618.3±7.914.1±5.3#14.3±3.9#ICT40mg/kg39.2±21.529.3±13.716.8±6.4#14.5±6.1#13.8±4.3#ICT80mg/kg32.5±18.925.8±13.316.4±6.0#11.9±4.2#13.4±3.7#

与对照组相比 *P< 0.05，与模型组相比 #P< 0.05。

组别搜索距离(m)d10d11d12d13d14对照组13.1±7.112.6±7.210.7±4.58.6±3.49.4±3.1模型组36.8±22.8*32.8±16.6*25.0±8.8*17.9±7.5*15.3±5.6*ICT20mg/kg33.9±20.927.7±12.418.0±7.612.4±5.110.9±4.5#ICT40mg/kg33.5±18.226.4±14.116.0±6.4#10.6±4.8#9.6±4.1#ICT80mg/kg28.8±16.822.1±8.714.8±5.7#7.6±4.1#8.8±3.3#

与对照组相比， *P< 0.05；与模型组相比， #P< 0.05。

2.2ICT对痴呆模型大鼠海马组织中AchE和ChAT含量的影响Aβ25-35造模后，与对照组相比，模型组大鼠海马组织中AchE和ChAT含量明显下降。ICT各剂量治疗组大鼠灌胃2周后，与模型组相比，AchE和ChAT含量均显著增加(见表3)。

组别AchE(nmol/L)ChAT(nmol/L)对照组30.1±4.279.1±16.2模型组26.5±4.9*60.5±12.7*ICT(20mg/kg)30.8±6.2#72.2±19.0#ICT(40mg/kg)34.7±4.0##79.9±9.7##ICT(80mg/kg)35.0±3.6##81.7±8.7##

与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

3讨论

全球范围内大约有3500万人患有痴呆，其中大部分是AD，预计到2030年这个数目将达到6500万人[9]，但目前尚缺乏有效的对因治疗药物。理想的痴呆动物模型是筛选抗痴呆药物的重要前提，常用的痴呆模型仍主要模拟痴呆特征性的行为学、组织形态学和生化指标改变。其中，单侧海马内注射一种神经毒性物质Aβ能诱导大鼠出现明显的学习记忆能力减退，可复制出痴呆的行为学改变和部分病理生理学特征，该模型常用于筛选抗痴呆药物[7]，故本实验采用单侧海马内注射Aβ25-35诱导的大鼠神经毒性模型。结果表明，模型组大鼠在水迷宫中的逃避潜伏期及搜索距离明显延长，海马组织中ChAT及AchE含量显著下降，表明造模大鼠存在明显学习记忆能力减退和胆碱能神经功能的降低，与既往研究的结果一致[7]，可用于药物筛选。

学习记忆与中枢胆碱能系统有着密切的关系，中枢胆碱能系统可通过隔区-海马-边缘叶和大脑皮质两条通路特异性地调节第一级记忆转入第二级记忆的过程。因此，中枢胆碱能神经元是构成学习记忆的重要生物学基础。脑内胆碱能神经元退变以及乙酰胆碱的合成、储存、释放减少被认为是造成痴呆最重要的病理因素之一。ChAT可催化乙酰辅酶A和胆碱生成乙酰胆碱，是乙酰胆碱在脑内合成的关键酶；AchE则是乙酰胆碱水解的限速酶，可催化乙酰胆碱分解成胆碱和乙酸，ChAT和AchE共同维持乙酰胆碱的动态平衡。由于乙酰胆碱极不稳定，容易水解，很难准确测定其含量。因此，在实验中通过测定ChAT和AchE间接反映脑内乙酰胆碱水平[10]。

本研究模型组大鼠海马区内注射Aβ25-3514 d后，海马组织中ChAT及AchE含量较对照组明显下降，同时伴有逃避潜伏时间和搜索距离的明显延长，表明大鼠学习记忆功能受到损害。ICT治疗后海马组织中ChAT及AchE含量较模型组明显增加，且同时改善大鼠的学习记忆能力，提示ICT可能通过增加脑内乙酰胆碱水平，产生抗Aβ25-35神经毒性作用。ICT抗Aβ25-35神经毒性作用的确切机制有待进一步求证。

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[收稿2015-04-08;修回2015-05-11]

(编辑：谭秀荣)

基础医学研究

基础医学研究

Protective effects of icaritin on intracerebral cholinergic neuron damaged by 25-35 fragment of beta-amyloid in rats

FengFei，ChenQian，SongBin，XiongDeqing，LuoYong

(Department of Neurology, The Third Affiliated Hospital of Zunyi Medical University，Zunyi Guizhou 563003，China)

[Abstract]Objective To explore the protective effect of Icaritin (ICT) on intracerebral cholinergic neuron damaged by 25-35 fragment of beta-amyloid.Methods 40 SD rats (12 months) were randomly divided into control group, model group, ICT low dose group (20 mg/kg), ICT middle dose group (40 mg/kg) and ICT high dose group (80 mg/kg). The model group and ICT treatment groups were injected with A beta25-35in hippocampal area following ICT pretreatment of 3 days, and to measure the AChE and ChAT content through ELISA after 2 weeks of ICT intragastric administration.Results The rats in model group existed learning and memory dysfunction and the content of AChE and ChAT in the hippocampus of model group was significantly decreased than control group. Compared with model group, the learning and memory dysfunction was obviously improved and the content of AChE and ChAT in ICT treatment groups was increased significantly.Conclusion ICT can improve the learning and memory ability through protecting intracerebral cholinergic neuron function from damage caused by A beta in rats.

[Key words]alzheimer’s disease;icaritin;AchE;ChAT

[文献标志码][中图法分类号]R592A

[文章编号]1000-2715(2015)03-0248-03

[通信作者]罗勇，男，主任医师，硕士，研究方向：神经病学研究，E-mail:luoyongtt@163.com。

[基金项目]贵州省遵义市汇川区科学技术基金资助项目(NO:遵汇科合 [2014]16)；遵义市联合科学技术资助项目(NO:遵义市科合社字[2014]27)。