灵芝孢子粉对镉致雄性大鼠睾丸雄激素结合蛋白和抑制素表达的影响



灵芝孢子粉对镉致雄性大鼠睾丸雄激素结合蛋白和抑制素表达的影响

刘艳荣，葛振丹，金海，黄厚今

(遵义医学院 公共卫生学院，贵州 遵义563099)

[摘要]目的 观察灵芝孢子粉对镉致雄性大鼠睾丸雄激素结合蛋白和抑制素的影响。方法 45只SD雄鼠，随机均分为3组：对照组、Cd组、灵芝孢子粉拮抗组(GLS+Cd)。灵芝孢子粉拮抗组用5mg/kg灵芝孢子粉灌胃，对照组与Cd组灌胃等量生理盐水，每天1次。Cd组和GLS+Cd组腹腔注射CdCl22mg/kg，隔天1次。对照组腹腔注射等量生理盐水。3个月后分3批处死，间隔为1个月。用RT-PCR法对抑制素和雄激素结合蛋白的表达量进行定量分析，睾酮定量分析酶联免疫检测试剂盒测定血清睾酮浓度。结果 在镉染毒1个月时，Cd组ABP(雄激素结合蛋白)表达量应激性升高，在第3个月Cd组ABP表达量低于灵芝孢子粉拮抗组，有统计学意义(P<0.05)；随着镉染毒时间延长，第2、3个月Cd组INH-B(抑制素B)表达量低于灵芝孢子粉+Cd组，有统计学意义(P<0.05)；镉染毒3个月时，与对照组比较，Cd组和灵芝孢子粉拮抗组血清睾酮水平明显降低(P<0.05)；与Cd组比较，灵芝孢子粉+Cd组血清睾酮水平浓度高(P<0.05)。结论 灵芝孢子粉可以通过提高ABP、INH-B的表达对镉致雄性大鼠支持细胞损伤有一定的保护作用。

[关键词]镉；灵芝孢子；雄激素结合蛋白；抑制素B

镉(cadmium，Cd)是一种分布广泛，半衰期长，毒性持久的环境污染物[1]。近年来研究发现镉是新型的环境内分泌干扰物(endocrine disrupting chemical，EDC)，称为金属类激素，具有类雌激素作用[2]。EDC可干扰机体的内分泌产生生殖毒性、神经毒性、免疫毒性以及致癌致畸作用等毒性。其中生殖毒性占最高比例，尤其对雄性生殖毒性系统作用最为突出[3]。众多的体内外实验证实：镉具有生殖毒性，对精子、生精细胞、睾丸、附睾的功能和结构均有影响[4-6]。睾丸的支持细胞功能和精子形成有密切关系[7],支持细胞合成和分泌的抑制素(inhibin，INH)和雄激素结合蛋白(androgen binding protein，ABP)是其功能标志，其中在成年雄性体内INH的重要生理形式是INH-B[8]。研究灵芝孢子粉(Ganoderma lucidum spore，GLS)对镉致雄性大鼠INH-B和ABP的影响，可为镉致雄性生殖毒性的预防和治疗和灵芝孢子粉的临床应用进一步提供实验依据。

1材料与方法

1.1主要试剂与仪器分析纯氯化镉(美国Sigma公司)；灵芝孢子粉(由贵州吉仁堂药业有限公司馈赠)；睾酮定量分析酶联免疫检测试剂盒(上海巧伊生物科技有限公司)；总RNA试剂盒(lot:20140120)，cDNA合成试剂盒(lot:20140126)，SYBR GREEN荧光定量试剂盒(lot:20140113)，购于华兴创新(北京)科技有限公司。通用全自动酶标仪(美国Bio-Rad公司)；TU1810紫外可见分光光度计(北京普析仪器有限责任公司)；iCycler荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD)。

1.2动物分组及处理健康雄性SD大鼠45只，体重(152±20)g，由第三军医大学大坪医院动物中心提供，清洁级，合格证号：SCXK(渝)2007-0005。自由饮食，室温(23±2)℃，相对湿度50%～70%，光照每12小时明暗交替，适应性喂养7 d后随机均分3组，对照组、单独染镉(Cd)组、灵芝孢子粉拮抗组(GLS+Cd)。灵芝孢子粉拮抗组灌胃5 mg/kg灵芝孢子粉，对照组与Cd组灌胃等量生理盐水，每天1次。Cd组和GLS+Cd组腹腔注射CdCl22 mg/kg[9]，隔天1次。对照组腹腔注射等量生理盐水。3个月后分3批处死，间隔为1个月。末次给药24 h后，10%水合氯醛麻醉，取血、睾丸。

1.3血清睾酮浓度检测末次给药24 h后，10%水合氯醛麻醉腹主动脉取血3～5 mL，置于清洁的塑料试管中， 4 ℃冰箱静置24 h，离心(3 000 r/min，5 min)，取血清放置于4 ℃冰箱保存。按照睾酮定量分析酶联免疫检测试剂盒说明书进行测定。

1.4RT-PCR法检测ABP、INH-B的表达大鼠断头处死后取出双侧睾丸，置于-80℃冰箱中备用。-80℃冰箱中取出睾丸组织50mg，研磨组织，将研磨好的组织加入到冰预冷1mL细胞裂解液中，按照试剂盒提取RNA。用紫外分光光度计测定其纯度和含量；用凝胶成像分析系统观察RNA的完整性。按照反转录试剂盒操作说明将mRNA反转录为cDNA。根据从Genebank查找所得的目的蛋白的基因序列，设计特异性引物，引物由北京博乐通生物科技有限公司合成。ABP引物序列：上游5’-CTGGCTTGATTTCCCTTGTG-3’，下游5’-CCCTGTTGCTTGTC TTCCTC-3’,106bp；INH-B引物序列：上游5’-GTGGGCTGAGTGTGGTTGTT-3’，下游5’-CTCCCTCTGGTTCTGACTGG -3’,102bp；内参GADPH引物序列：上游5’-TGCAGTGCCAGCCTCGTCTC-3’，下游5’-TGAACTTGCCGTGGGTA-3’，192bp。PCR反应条件(SYBR Green Ⅰ嵌合荧光法)：ABP：94 ℃预变性3 min，Repeat:1，PCR反应94 ℃，15 s，Repeat:35，溶解曲线分析60.0～95.0 ℃，10 s，每2个周期后增加1 ℃，Repeat:36；INH-B：94 ℃预变性3 min，Repeat:1，PCR反应94 ℃，15 s，Repeat:45，溶解曲线分析55.0～95.0 ℃，10 s，每2个周期后增加1 ℃，Repeat:41；内参GADPH：94 ℃预变性2 min，Repeat:1，PCR反应94 ℃，15 s，Repeat:40，溶解曲线分析60.0～95.0 ℃，10 s，每2个周期后增加1℃，Repeat:36。分析每个基因的扩增产物，通过溶解曲线分析产物是否为所扩增的特异片断。

1.5ABP、INH-B定量分析方法利用大鼠睾丸组织中目标基因的Ct值，采用2-△△Ct法来进行相对定量，△Ct = Ct average (目的基因) - Ct average (内参基因)；△△Ct = △Ct (实验组) -△Ct(对照组)。2-△△Ct表示剂量组目的基因相对对照表达水平。

2结果

2.1对大鼠睾丸组织ABP表达水平的影响表1结果显示在镉染毒1个月后，Cd组ABP表达量应激性升高；染毒3个月后和Cd组比较，灵芝孢子粉+Cd组ABP表达量有统计学意义(P<0.05)。

组别1个月2个月3个月对照组1.07±0.481.10±0.501.08±0.50Cd组0.78±0.280.63±0.230.45±0.18灵芝孢子粉+Cd组0.57±0.060.95±0.42b0.64±0.34bF3.0385.3455.638P0.1040.0050.004

b与Cd组比较，P<0.05。

2.2对大鼠睾丸组织INH-B表达水平的影响表2结果显示在镉染毒2、3个月后， Cd组INH-B表达量低于灵芝孢子粉+Cd组，有统计学意义(P<0.05)。

组别1个月2个月3个月对照组1.05±0.381.01±0.251.22±0.83Cd组0.61±0.420.80±0.680.28±0.07a灵芝孢子粉+Cd组0.81±0.731.98±0.04b1.00±0.73abF1.9095.2574.478P0.2100.0140.037

a与对照组比较，P<0.05；b与Cd组比较，P<0.05。

2.3对大鼠血清睾酮浓度水平的影响图1显示镉染毒3个月后，和对照组比较，Cd组和灵芝孢子粉+Cd组血清睾酮水平明显降低，有统计学意义(P<0.05)；和Cd组比较，灵芝孢子粉+Cd组血清睾酮水平浓度高，有统计学意义(P<0.05)。

*P<0.05各组分别与对照组比较，** P<0.05灵芝孢子粉+Cd组与Cd组比较。图1　染毒3个月各组血清睾酮水平比较

3讨论

研究证实重金属镉具有内分泌干扰效应并可影响雄性生殖系统，且镉造成生殖系统损伤首先作用于睾丸[10-12]。支持细胞是睾丸曲细精管内唯一的体细胞，不仅能对生精细胞提供营养支持，还能分泌多种具有内分泌调节作用的活性物质[8,13]，近年来，评价支持细胞的功能也成为生殖学研究的一个新亮点。

本文以ABP、INH-B基因表达和血清睾酮T浓度水平含量来反映镉染毒对生殖损伤的影响。在镉染毒1个月后，Cd组ABP表达量有增高趋势，提示为维持正常生精环境，ABP基因表达应激性增高。随着染毒时间的延长Cd组ABP表达量逐渐降低；染毒3个月后，灵芝孢子粉+Cd组ABP表达量相对于Cd组有统计学意义(P<0.05)，这和以往研究一致[14]。抑制素在男性精子发生、形成过程起重要作用[15]。本实验结果显示随着镉染毒时间的延长，第2、3个月Cd组INH-B表达量明显低于灵芝孢子粉+Cd组，有统计学意义(P<0.05)。间质细胞分泌的T可促进和维持精子发生成熟，有广泛的生理作用[16]。本结果显示镉染毒3个月后，和对照组比较，Cd组和灵芝孢子粉拮抗组血清睾酮有明显下降(P<0.05)；灵芝孢子粉拮抗组血清睾酮浓度水平高于Cd组，有统计学意义(P<0.05)。

灵芝孢子粉是灵芝的生殖细胞，具有灵芝的全部活性物质。除此之外，灵芝孢子内含有比灵芝更为丰富的多糖肽、腺嘌呤核苷、蛋白质、酶类、硒元素等特殊成份[17]。具有清除自由基、抗肿瘤、抗炎、保肝、降血清胆固醇、降血糖、抗辐射、增强免疫功能、抗病毒等广泛药理作用[18]。其抗氧化的作用效果也早已有报道[19]，前期本课题组关于灵芝孢子粉已做了一定的工作，证实[20]灵芝孢子粉可以提高金属硫蛋白的含量，提高超氧化物歧化酶SOD的活力，降低丙二醛MDA的含量，有效降低镉致大鼠睾丸生殖细胞DNA氧化损伤，灵芝孢子粉的抗氧化作用可能是其拮抗镉染毒造成支持细胞损伤的主要机制。以往关于中药拮抗镉致生殖损伤的报道有很多[21-22]，灵芝孢子粉作为有名的中药之一，尚未见类似报道。本文将为灵芝孢子粉的进一步临床应用提供更多实验数据。

综上，镉染毒可以使ABP、INH-B基因表达水平和血清T浓度水平下降造成睾丸支持细胞损伤。而灵芝孢子粉可以拮抗引起的损伤，为灵芝孢子粉的临床应用提供了进一步的理论依据。

[参考文献]

[1] Ogawa Y,Itoh M,Hirai S, et al. Cadmium exposure increases susceptibility to testicular autoimmunity in mice[J].J App Toxicol，2013,33(7):652-660.

[2] 叶斯阳,余日安. 镉金属类雌激素作用及其机制研究进展[J]. 中国职业医学,2014,41(4):465-469.

[3] 李欣,李丽,赵冰海,等. 环境内分泌干扰物对机体的影响[J]. 牡丹江医学院学报,2011,32(6):46-47.

[4] Zhang M,He Z, Wen L, et al. Cadmium suppresses the proliferation of piglet Sertoli cells and causes their DNA damage, cellapoptosis and aberrant ultrastructure [J]. Reprod Biol Endocrinol，2010,8:97.

[5] Siu E R,Mruk D D,Porto C S,et al.Cadmium-induced Testicular Injury[J]. Toxicol Appl Pharmacol，2009,238(3):240-249.

[6] Souza Predes E, Diamante M A,Dolder H.Testis response to low doses of cadmium in Wistar rats[J]. Int J Exp Path，2010,91(2):125-131.

[7] Zimmermann C, Stévant I, Borel C, et al. Research Resource: The dynamic transcriptional profile of Sertoli cells during the progression of spermatogenesis[J]. Mol Endocrinol,2015,29(4):627-642.

[8] Xu R, Shang W, Liu J, et al. Influence of fluorine on expression of androgen-binding protein and inhibin B mRNA in rat testis sertoli cells[J]. Journal of Hygiene Research ，2010,39(5):615-617.

[9] Ahmed , Anwar, Albir. Histological Changes in The Liver of Mice Treated with Cadmium[J]. Iraqi Journal of Science，2013,54(1):50-54.

[10] 俞旭波,陈加祥. 环境内分泌干扰物对雄性生殖毒性的影响[J]. 南昌大学学报：医学版,2013,53(7):76-79.

[11] Knazicka Z, Forgacs Z, Lukacova J, et al. Endocrine disruptive effects of cadmium on steroidogenesis: Human adrenocortical carcinoma cell line NCI-H295R as a cellular model for reproductive toxicity testing[J]. J Environ Sci Health A Tox Hazard Subst Environ Eng，2015,50(4):348-356.

[12] 安立会,王静波,付青,等.环境镉污染对生殖系统影响的研究进展[J]. 环境与健康杂志,2011,28(1):89-92.

[13] 宋中立,刘海东,王祚懿,等. 重铬酸钾对大鼠睾丸支持细胞中雄激素结合蛋白转铁蛋白和抑制素蛋白表达的影响[J].郑州大学学报：医学版，2012,47(4):479-481.

[14] 张圣强,刘保兴,王鑫,等. 五子衍宗丸含药血清对大鼠睾丸支持细胞分泌产物的影响[J]. 中华中医药杂志,2013,28(3):631-634.

[15] 王瑞,王磊,张卫星,等. 葛根素对钴60-γ射线致小鼠睾丸支持细胞急性损伤的保护作用[J]. 中国中西医结合杂志,2012,32(3):385-389.

[16] 崔蕊蕊,丁中,崔留欣,等. 饮水氟暴露对成年男性血清睾酮及雄激素结合蛋白的影响[J]. 郑州大学学报：医学版,2013,48(6):750-753.

[17] 唐柳,张志军,魏雪生,等. 灵芝孢子粉药理作用研究进展[J]. 天津农业科学,2011,17(3):25-28.

[18] Boh B. Ganoderma lucidum: A Potential for Biotechnological Production of Anti-Cancer and Immunomodulatory Drugs[P]. Recent Pat on Anticancer Drug Discov，2013,8(3), 255-287.

[19] 李野,刘祥燕,娄雪. 灵芝孢子粉对力竭小鼠抗氧化、抗损伤的作用[J]. 吉林体育学院学报,2008,24(5):76-77.

[20] Jin H,Jin F,Jin J X, et al. Protective effects of Ganoderma lucidum spore on cadmium hepatotoxicity in mice[J]. Food Chem Toxicol，2013,52:171-175.

[21] 陈福欣,龚频,金赛,等. 镉损伤睾丸病理变化及蓝莓花青素保护作用[J]. 时珍国医国药,2013,24(3):576-578.

[22] 毛胜艳,廖晓岗,姜蓉,等. 黄芪甲苷对镉致大鼠支持细胞损伤的保护作用[J].激光杂志,2011,32(4):84-86.

[收稿2015-04-23;修回2015-05-18]

(编辑：谭秀荣)

基础医学研究

Protective effect of ganoderma lucidum spore on androgen protein and inhibin expressions by cadmium in rat testis

LiuRanrong,GeZhendan,JinHai,HuangHoujin

(School of Public Health, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To investigate the protective effects of ganoderma lucidum spore (GLS) on androgen protein (ABP) and inhibin (INH) expression by cadmium (Cd) in rat testis.Methods Forty five male SD rats were randomly and equally divided into blank control group, Cd group, GLS+Cd group. 5 mg/kg of GLS was given to GLS anti-cadmium group every day, the control group and Cd group were given with 0.9% normal saline, the cadmium alone group and GLS anti-cadmium group were intraperitoneally injected with CdCl2solution of 2 mg/kg, every other day, for three months. Then the rats were sacrificed after 30,60 and 90 days respectively and their blood and testes were reserved for further tests. The mRNA of androgen protein (ABP)and inhibin-B (INH-B) were measured by RT-PCR, and the quantitative analysis of testosterone (T) was determined by the ELISA method.Results Compared with GLS+Cd group, the increase of ABP in Cd group after 1 months, and the decrease of ABP in Cd group after 3 months were significant (P<0.05). Compared with blank and GLS+Cd group, the INH-B expressions decreased in Cd group with the time (P<0.05) after 2 or 3 months. Meanwhile, the decrease of T in Cd and GLS+Cd group was significant (P<0.05) after 3 months compared with control group, and the decrease of T in Cd group was more significant (P<0.05) after 3 months than that of GLS+Cd group.Conclusion Ganoderma lucidum spore could significantly improve the expressions of ABP and INH-B, so as to achieve the role of protecting Sertolicells in rat testis induced by Cd.

[Key words]cadmium; GLS; androgen protein; inhibin-B

[文献标志码][中图法分类号] R285.5A

[文章编号]1000-2715(2015)03-0244-04

[基金项目]贵州省科技厅联合基金重点科研项目(NO：黔科合J字LKZ[2013]05)。

[通信作者]黄厚今，男，博士后，教授，硕士生导师，研究方向：营养毒理学，E-mail:huanghj6688@163.com。