皮肤鳞状细胞癌皮损中p-Akt，p-Stat3，CyclinD1的表达及意义



皮肤鳞状细胞癌皮损中p-Akt，p-Stat3，CyclinD1的表达及意义

雷微1，陈永艳1，袁伟1，但翠娟2，李路3，沈孟奇1

(1.遵义医学院附属医院 皮肤科，贵州 遵义563099；2. 宁波市妇女儿童医院 皮肤科，浙江 宁波315016;3.贵州省航天医院 皮肤科，贵州 遵义563000)

[摘要]目的 检测磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化细胞信号转导与转录活化因子3(p-Stat3)、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)在皮肤鳞状细胞癌中的表达。方法 采用免疫组化SP方法检测20例皮肤鳞状细胞癌(SCC)和10例正常人皮肤组织中p-Akt, p-Stat3和CyclinD1蛋白的表达水平，利用图像分析技术测量细胞阳性表达的平均光密度值，并分析三种蛋白表达的相关性。结果 SCC组中p-Akt、p-Stat3和CyclinD1的平均光密度值均明显高于正常皮肤(NOM)组(P<0.01)；p-Stat3、CyclinD1蛋白的表达与SCC不同分化程度和浸润深度有关(P<0.05)，p-Akt在SCC不同分化程度和浸润深度的组织中表达差异无统计学意义(P>0.05)；p-Akt与CyclinD1的表达，p-Stat3与CyclinD1的表达及p-Stat3与p-Akt的表达呈正相关(r=0.551, 0.502, 0.698, P<0.05)。结论 ①SCC中存在p-Akt、p-Stat3和CyclinD1蛋白的高表达，三者可能在SCC的发生、发展中起重要作用；②p-Stat3在SCC中的表达强度与肿瘤的分化程度和浸润深度有关。

[关键词]皮肤鳞状细胞癌；磷酸化蛋白激酶B；磷酸化细胞信号转导与转录活化因子3；细胞周期蛋白D1

细胞信号转导异常是导致细胞癌变的重要因素，信号转导途径将异常生长、增殖、分化信号传至细胞而导致癌变。原癌基因蛋白激酶B(Protein kinase, PKB/Akt)及细胞信号转导与转录活化因子3(signal transducers and activators of transcription3, Stat3)，分别是PI3K/Akt和JAK/Stat3两条细胞信号转导途径中的重要成员，细胞周期蛋白D1(cyclicproteinD1, CyclinD1)是PI3K/Akt和JAK/Stat3信号转导途径的下游靶基因，其异常表达可加速细胞周期循环过程，导致细胞持续异常分化、增殖而使细胞发生癌变。本实验采用免疫组织化学SP法检测p-Akt、p-Stat3和CyclinD1蛋白在皮肤鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma SCC)中的表达，并对这几种蛋白的表达作相关性分析，探讨其在SCC发生、发展中的作用及意义。

1 材料与方法

1.1标本来源石蜡标本均来自我院2001～2011年皮肤科病理室经组织病理确诊的门诊及住院病例。皮肤鳞状细胞癌20例，男性10例，女性10例；年龄38～85岁，平均65.1岁；病程1月～20年，平均病程3.3年；取材部位：头、面、四肢、躯干。根据Broders提出的病理分级法[1]将20例SCC分为：Ⅰ级6例，Ⅱ级7例，Ⅲ级7例；根据不同浸润深度分为：真皮内 14例 皮下组织 6例；20例患者均未发现淋巴结转移。正常皮肤组织来自我院手术室外科整形手术切除多余的皮肤，其中6例男性，4例女性，年龄10～66岁，平均38岁。

1.2主要试剂p-Akt(Ser473)兔多克隆抗体和p-Stat3(Tyr705)兔多克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，工作浓度均为1∶100。CyclinD1研究试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司,工作浓度均为1∶50。

1.3免疫组化SP法切片常规脱蜡至水，抗原复性液高温法修复抗原(p-Akt 采用微波修复；p-Stat3、CyclinD1均采用高压修复)，操作步骤按试剂盒说明书进行，经DAB显色，苏木素复染，脱水干燥、透明、中性树胶封片。以乳腺癌石蜡切片作为阳性对照，以PBS液代替一抗为阴性对照。

1.4结果判定由2位病理科医生在独立情况下对免疫组化结果进行评估。p-Akt为细胞浆出现棕黄色和(或)棕褐色颗粒为阳性表达；p-Stat3为细胞核出现棕黄色和(或)棕褐色颗粒为阳性表达；CyclinD1为细胞核出现棕黄色和(或)棕褐色颗粒为阳性表达。每张组织切片应用Image-Pro Plus6.0彩色分析系统在200倍视野下随机选取表皮中5个阳性表达区域，测量细胞阳性表达的平均光密度值，取每个组织标本的p-Akt、p-Stat3、CyclinD1蛋白的平均值作为相对量进行定量分析。

2结果

2.1p-Akt、p-Stat3、CyclinD1的表达(见表1)p-Akt在SCC组中阳性染色可见于肿瘤细胞的细胞浆； NOM组中无p-Akt的阳性表达(见图1、2)。p-Stat3在SCC组中阳性染色见于肿瘤细胞的细胞核；NOM组中呈阴性表达(见图3、4)。CyclinD1在SCC组中的阳性染色见于肿瘤细胞的细胞核；NOM组中疑似少量CyclinD1弱阳性表达见于表皮基底细胞层(见图5、6)。

组别例数p-Aktp-Stat3CyclinD1SCCNOM20100.118±0.0150a0.159±0.0180a0.212±0.0250.049±0.020a

aP<0.01, vs. SCC。

2.2p-Akt、p-Stat3与CyclinD1在不同分化程度及浸润深度组织中阳性表达见表2，p-Stat3、CyclinD1蛋白的阳性表达在Ⅰ级与Ⅱ-Ⅲ级组中比较差异均具有统计学意义(tp-Stat3=-3.752,tCyclinD1=-3.119,P<0.05)，而p-Akt在两组间的阳性表达比较差异无统计学意义(tp-Akt=-1.138,P>0.05)。p-Stat3和CyclinD1在局限于真皮内和浸润至皮下组织两组之间的阳性表达比较差异有统计学意义(tp-Stat3=-2.536,tCyclinD1=

-2.456,P<0.05)，而p-Akt在不同浸润深度组织间的阳性表达比较差异无统计学意义(tp-Akt=0.610,P>0.05)。

2.3p-Akt、p-Stat3、CyclinD1三者表达的相关性p-Akt与CyclinD1在SCC中的表达呈正相关(r=0.551,P<0.05)；p-Stat3与CyclinD1在SCC中的表达呈正相关(r=0.502,P<0.05)；p-Stat3与p-Akt在SCC中的表达呈正相关(r=0.698,P<0.05)。

组别例数p-Aktp-Stat3CyclinD1分化程度Ⅰ级60.091±0.0200.090±0.029a0.082±0.037aⅡ-Ⅲ级140.129±0.0200.198±0.0190.245±0.024浸润深度真皮内140.125±0.0160.093±0.032b0.175±0.027b皮下组织60.101±0.0370.187±0.0190.298±0.042

与Ⅱ-Ⅲ级比较，aP<0.05 ; 与皮下组织比较，bP<0.05。

3讨论

皮肤鳞状细胞癌(SCC)是一种增殖较快，发生于表皮和(或)附属器角朊细胞的恶性肿瘤，发病率逐年上升，对人类健康造成严重危害，但其发病的确切分子机制并不完全清楚。大量研究表明肿瘤细胞失控性持续增殖是皮肤肿瘤同其他肿瘤一样具有的特性，皮肤肿瘤的发生、发展与细胞信号的传导异常密切相关。肿瘤的恶性行为通过观察肿瘤细胞的分化程度来判断，恶性程度越高，分化越低，浸润转移越容易，预后也越差。

Akt是一种存在于人类染色体中的癌基因，作为磷脂酰肌醇-3羟基激酶 (PI3K)下游关键效应分子，受生长因子刺激后磷酸化的PI3K使Akt的构象改变，磷酸化其重要的2个结合位点(Ser473、Thr308)，进而通过灭活多种凋亡效应分子、调控细胞周期、激活端粒酶活性、促进血管生成和迁移相关程序等途径而促进肿瘤的生长和侵袭[2]。Russo AE等[3]研究发现，黑素瘤的发生机制是由于PI3K/Akt信号系统的Akt激活，进而激活Akt下游的一系列靶基因，导致细胞分化、衰老异常、细胞异常增殖及恶性转化。本实验结果显示p-Akt蛋白在SCC组织中呈高表达，与NOM组织比较差异有统计学意义(P<0.05)，推测p-Akt蛋白表达水平的高低可能与SCC的发生、发展关系密切。我们进一步研究发现p-Akt蛋白在SCC不同分化程度和不同浸润深度中阳性表达的比较差异均无统计学意义(P>0.05)，这一结果与Richter P等[4]研究发现随着口腔鳞癌的恶性程度的加深，p-Akt蛋白染色显著增强的结果不完全一致，可能与本实验样本量少有关，以后我们将加大样本量进一步探讨Akt信号转导途径是否也参与SCC的侵袭性发展。

Stat3作为Stats家族中被认定的癌基因之一，许多研究证实在多种恶性肿瘤组织和细胞中发现Stat3异常持续活化。细胞处于静息状态时，Stat3主要分布于细胞浆中，当JAK蛋白酪氨酸激酶接受细胞外信号刺激后，Stat3的酪氨酸基团被磷酸化而激活成p-Stat3，形成的同源或异源二聚体遂转位入核并诱导调控其下游与细胞增殖、分化、凋亡密切相关的基因异常高表达进而表现出致癌作用。在皮肤血管肉瘤、Kaposi's 肉瘤中均发现p-Stat3呈高表达状态[5-6]。我们研究发现p-Stat3蛋白在SCC组织中的表达高于NOM组织，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)；p-Stat3蛋白在SCC不同分化程度和浸润深度中阳性表达的比较差异均有统计学意义(P<0.05)，这与赵洪春等[7]研究结果一致 ，提示p-Stat3蛋白的过度表达可能与SCC的发生及恶性生物行为密切相关。

CyclinD1作为细胞周期素(Cyclins)家族中重要的一员，在细胞周期进展过程中起重要的调节作用。当接受细胞外信号刺激后CyclinD1呈异常表达状态时，细胞增殖周期出现失控，肿瘤因而发生。作为p-Stat3、p-Akt的下游靶基因，CyclinD1参与PI3K/Akt和JAK/Stat3信号转导途径促进肿瘤形成和发展的过程。Leslie等[8]研究提示CyclinDl mRNA和蛋白在Stat3的活化调控下呈放大状态，导致细胞恶性转化。PI3K/Akt信号转导途径可通过调控基因转录、mRNA翻译和蛋白质稳定性等阻止CyclinD1降解，参与肿瘤发生[9]。本实验结果显示CyclinD1蛋白在SCC组织中的的表达高于NOM组织，并且与p-Akt、p-Stat3蛋白的表达呈正相关，提示p-Akt、p-Stat3可能分别通过PI3K/Akt和JAK/Stat3两条信号转导途径诱导CyclinD1的过度表达，进而促进肿瘤细胞的生长及增殖，与本课题组前期在Paget病中的研究结果相一致[10]。

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[10]但翠娟, 陈永艳, 袁伟, 等. Paget病皮损中p-Stat3, p-Akt, cyclinD1蛋白的表达及其相关性分析[J].中国皮肤性病学杂志, 2012, 26(7): 5-8.

[收稿2015-04-15;修回2015-05-20]

(编辑：王福军)

临床医学研究

Expression of phosphorylated-Akt，phosphorylated-Stat3 and CyclinD1 in squamous cell carcinoma

LeiWei1,ChenYongyan1,YuanWei1,DanCuijuan2,LiLu3,ShenMengqi1

(1.Department of Dermatology,The Affiliate Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099,China;2.Department of Dermatology,Ningbo Women & Children's Hospital,Ningbo Zhejiang 315016,China;3.Department of Dermatology,Guizhou Aerospace Hospital,Zunyi Guizhou 563000,China)

[Abstract]Objective To investigate the significance of phosphorylated protein kinase B (p-Akt),phosphorylated signal transductor and activator of transcription3 (p-Stat3) and Cyclic proteinD1(CyclinD1) protein expression in the squamous cell carcinoma(SCC).Methods The expressions of p-Akt, p-Stat3 and CyclinD1 were detected by Immunohistochemistry in 20 cases of SCC and 10 cases of normal human skin tissues. The positive protein expressions of p-Akt, p-Stat3 and CyclinD1 were measured and quantified by Image analysis and the mean optical density was determined. These protein expressions and their relationship with the pathological factors were analyzed.Results The mean optical density of p-Akt, p-Stats3 and CyclinD1 protein were obviously higher in SCC group than those in normal skin (NOM) group (P<0.01).The expressions of p-Stat3 and CyclinD1 protein were correlated with the tumor differentiation degree and the depth of tumor invasion in SCC (P<0.05), but the expression of p-Akt didn’t differ (P>0.05). In SCC, positive correlation between expressions of p-Stat3 and CyclinD1, p-Akt and CyclinD1, p-Stat3 and p-Akt (r were 0.551, 0.502 and 0.698 respectively, P<0.05) were found.Conclusion 1)There were high-expressions of p-Akt, p-Stat3 and CyclinD1 in SCC, which may play an important role in the development of SCC. 2) The expression intensity of p-Stat3 was correlated with both the tumor differentiation degree and the depth of tumor invasion in SCC.

[Key words]squamous cell carcinoma; phosphorylated-Akt; phosphorylated-Stat3; CyclinD1

[文献标志码][中图法分类号] R739.5 A

[文章编号]1000-2715(2015)03-0275-04

[基金项目]贵州省科学技术基金项目(NO:gzwkj2008-1-027)。

[通信作者]陈永艳，女，教授，硕士生导师，研究方向：皮肤分子生物学，E-mail:cyyzy@126.com。