人表皮生长因子受体2、核因子-κB及血管内皮生长因子在胃癌组织中的表达及其临床意义▲

文亦磊 欧海玲 赖燕燕 崔锦珠

(1 广西中医药大学第一附属医院病理科，南宁市 530023，E-mail：wenyilei@aliyun.com；

论著·临床研究

人表皮生长因子受体2、核因子-κB及血管内皮生长因子在胃癌组织中的表达及其临床意义▲

文亦磊1欧海玲1赖燕燕2崔锦珠1

(1 广西中医药大学第一附属医院病理科，南宁市 530023，E-mail：wenyilei@aliyun.com；

2 广西卫生职业技术学院遗传学教研室，南宁市 530023)

目的 探讨胃癌组织中人表皮生长因子受体2(HER-2)、核因子-κB(NF-κB)及血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况及其临床意义。方法 应用免疫组织化学方法(S-P法)检测126例胃癌组织、54例正常胃黏膜组织中HER-2、NF-κB及VEGF蛋白表达情况，分析三者的相关性及其表达与胃癌临床病理特征间的关系。结果 (1)胃癌组织中HER-2高表达率为21.4%(27/126)，NF-κB及VEGF蛋白的阳性表达率分别为53.9%(68/126)、58.7%(74/126)，均明显高于正常胃黏膜组织(P<0.05)；(2)低分化胃癌组、淋巴结转移组、TNM Ⅲ+Ⅳ期组患者的胃癌标本中HER-2蛋白高表达率较高(P<0.05)；低分化胃癌组、浆膜或浆膜外浸润组、TNM Ⅲ+Ⅳ期组患者的胃癌标本中NF-κB蛋白阳性率较高(P<0.05)；浆膜或浆膜外浸润组、淋巴结转移组、TNM Ⅲ+Ⅳ期组患者的胃癌标本中VEGF蛋白阳性率较高(P<0.05)。(3)胃癌组织中HER-2与NF-κB、HER-2与VEGF、NF-κB与VEGF表达均呈正相关性(P<0.05)。结论 胃癌组织中HER-2、NF-κB及VEGF的阳性表达增高。HER-2可激活NF-κB以影响胃癌的发展和预后，激活VEGF可促进肿瘤的生长与转移，三者的协同作用对于研究胃癌的信号传导网络及分子靶向药物治疗有重要意义。

胃癌；人表皮生长因子受体2；核因子-κB；血管内皮生长因子；免疫组织化学

胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤，其死亡率居全世界癌症死亡率的第二位[1]。我国每年新增胃癌患者80万人，每年死于胃癌的人数约16万人，死亡率为25.16/10万，无论是发病率还是死亡率胃癌均居恶性肿瘤的前列。大多数患者来院就诊时，已处在进展期或晚期，虽然可通过手术、放疗、化疗等措施进行治疗，但治疗效果不理想。近年来，随着分子生物学与病理学的交叉融合，对胃癌发病机制及治疗的研究已经达蛋白、基因水平。人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)基因扩增可增强酪氨酸激酶活性，再通过对多条途径的作用而影响细胞的增殖、转化和凋亡，从而在肿瘤的发生发展中起到重要作用[2]。核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是信号传导通路中重要的上游因子，主要在调控细胞增殖、分化和凋亡等方面发挥作用，NF-κB失调涉及肿瘤发生发展和耐药[3]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是内皮细胞特异性的有丝分裂原，能促进内皮细胞的分裂增殖，促进血管和淋巴管的生成，对肿瘤的转移产生影响[4]。本文采用免疫组化方法检测HER-2、NF-κB和VEGF在胃癌组织中的表达情况，以了解三者之间的相关性及其与胃癌临床病理特征的关系，并探讨三者影响胃癌发生发展的可能机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择广西中医药大学第一附属医院2009年1月至2015年10月收治胃癌患者126例，获取其手术切除并经病理检测证实为胃癌的蜡块标本。纳入标准：病理类型均为腺癌，临床及病理资料完整。排除标准：术前进行放疗、化疗者。其中男性71例，女性55例；年龄34～86岁，中位年龄57岁；58例肿瘤直径<5 cm，68例肿瘤直径≥5 cm；根据分化程度：高-中分化59例，低分化67例；浸润深度为浸润黏膜层、黏膜下层或肌层者44例，浸润浆膜层或浆膜外者82例；有淋巴结转移者74例，无淋巴结转移者52例；临床TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期51例，Ⅲ～Ⅳ期75例。另选54例正常胃黏膜作为对照组，纳入标准：轻-中度慢性胃炎中的胃镜活检组织。排除标准：经病理检测为不典型增生及肠上皮化生者。其中男性21例，女性23例；年龄29～80岁，中位年龄58岁。

1.2 主要试剂及检测方法 鼠抗人HER-2、NF-κB 及VEGF单克隆抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。免疫组织化学法采用S-P法。标本使用10%甲醛溶液固定过夜，石蜡包埋后5 μm厚切片。选取1张常规采用苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色进行病理诊断，另外3张进行免疫组化检测。切片常规脱蜡水化后，柠檬酸高压修复，3% H2O2阻断内源性过氧化物酶，其余步骤按试剂盒说明进行操作。用磷酸缓冲盐溶液替代一抗作为阴性对照，用已知阳性片作为阳性对照。

1.3 结果判读

1.3.1 HER-2的判读：采用Hofmann等[5]推荐的胃癌HER-2蛋白检测评分标准：阳性着色为棕黄色信号定位于细胞膜；无着色或<10%肿瘤细胞膜着色为0/阴性；≥10%肿瘤细胞呈微弱、不完整的细胞膜着色为+/阴性；≥10%肿瘤细胞呈弱至中等强度完整的细胞膜着色为2+/不确定；≥10%肿瘤细胞呈强的、完整的细胞膜着色为3+/阳性。其中0和+视为低表达，2+和3+视为高表达。

1.3.2 NF-κB和VEGF的判读采用半定量法[6]：NF-κB阳性表达部位为胞质和(或)胞核；VEGF阳性表达部位为胞质。先根据细胞的染色范围计分，阳性细胞数<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分；再根据阳性细胞染色强度计分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；最后根据两者相加所得的总分进行结果判读：<3分为阴性(-)，≥3分为阳性(+)。

1.4 统计学分析 应用SPSS 21.0软件进行统计学分析，计数资料采用χ2检验，相关性分析采用秩相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HER-2、NF-κB、VEGF在胃癌组织和正常胃黏膜中的表达 胃癌组织中HER-2呈高表达，NF-κB及VEGF均呈阳性表达，见图1、图2、图3。胃癌组的HER-2高表达率、NF-κB及VEGF阳性表达率明显高于正常胃黏膜组(P<0.05)，见表1。

图1 胃癌中HER-2高表达(S-P染色，×200)图2 胃癌中NF-κB的表达(S-P染色，×200) 图3 胃癌中VEGF的表达(S-P染色，×200)

表1 两组HER-2、NF-κB、VEGF阳性率比较(n)

2.2 HER-2、NF-κB、VEGF表达与胃癌临床病理特征的关系 低分化胃癌组、淋巴结转移组、TNM Ⅲ+Ⅳ期组患者的胃癌标本中HER-2蛋白高表达率较高(P<0.05)；低分化胃癌组、浆膜或浆膜外浸润组、TNM Ⅲ+Ⅳ期组患者的胃癌标本中NF-κB蛋白阳性率较高(P<0.05)；浆膜或浆膜外浸润组、淋巴结转移组、TNM Ⅲ+Ⅳ期组患者的胃癌标本中VEGF蛋白阳性率较高(P<0.05)。见表2。

表2 HER-2、NF-κB、VEGF表达与胃癌临床病理特征的关系

2.3 胃癌组织中HER-2、NF-κB、VEGF表达的关联性 胃癌组织中HER-2与NF-κB呈正相关(r=0.288，P=0.01)，HER-2与VEGF表达呈正相关(r=0.202，P=0.02)，NF-κB与VEGF表达呈正相关(r=0.293，P=0.001)。

3 讨 论

HER-2是表皮生长因子受体家族成员之一，能通过多种途径参与细胞内的信号转导。HER-2可以通过丝裂原活化蛋白激酶和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶两种途径分别上调周期素D1和环氧酶-1的表达，抑制细胞凋亡并使细胞进入永生状态，从而在肿瘤的发生发展阶段发挥重要作用[7]。本实验中胃癌组织高表达HER-2蛋白(21.4%)，而正常组织无HER-2蛋白表达(0%)，进一步证实HER-2基因激活为胃癌发生始动因素之一的观点。另外，HER-2还可以增强基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2、MMP-7、MMP-9降解细胞外基质的能力，从而促进肿瘤的浸润和转移，本研究结果亦显示，淋巴结转移病例的HER-2高表达率(28.4%)高于无淋巴结表达病例(11.5%)(P<0.05)。有研究表明，HER-2基因的扩增和过表达与较低的中位生存期及较差预后具有相关性[8-9]，而本实验中低分化胃癌病例和Ⅲ、Ⅳ期病例的HER-2高表达率分别高于高分化胃癌和Ⅰ、Ⅱ分期的病例(P<0.05)。这提示HER-2蛋白可能与胃癌分化程度、淋巴结转移和TNM分期有关，表明HER-2基因可作为预测胃癌预后的指标之一，并提示该基因的扩增和过表达在胃癌发生发展中扮演了重要的角色。

NF-κB是一种广泛存在于真核细胞中的多效核转录因子，参与炎症、免疫反应、细胞增殖与凋亡等多种病理生理过程的基因调控。Makino等[10]的研究发现HER-2蛋白可以通过Pi3k-Akt途径激活NF-κB的表达，被激活的NF-κB进入胞核后可以通过以下方式抑制细胞凋亡，促进肿瘤的发生：(1)通过激活B细胞淋巴瘤-2蛋白发挥抗凋亡作用；(2)通过上调C-IAP的表达，从而抑制半胱天冬酶-8的活化，阻止凋亡的发生；(3)通过调控各种细胞因子的表达而间接抑制细胞凋亡的发生。本研究结果表明，胃癌组织中HER-2与NF-κB的表达呈正相关，与安杰等[11]的研究一致，这提示HER-2作为上游的调控因子，可激活NF-κB的表达，两者发生协同效应，从抗凋亡、细胞永生、肿瘤浸润及转移等方面共同促进了胃癌的发生发展。本研究发现NF-κB在低分化胃癌组、浆膜或浆膜外浸润组、TNM Ⅲ+Ⅳ期组患者的胃癌标本中NF-κB蛋白阳性率较高(P<0.05)，提示NF-κB与胃癌分化程度、浸润深度和TNM分期有关，其作为一个核心调控位点，对肿瘤的发展、预后有重要的影响，也为后续胃癌的基因靶向治疗研究提供了一个参考位点。

VEGF是作用最强、特异性最高的血管生成因子之一，其本身不能促进癌细胞的增殖，但能通过刺激淋巴管、血管的内皮细胞增殖、迁移和管腔形成在肿瘤生长和发展中起重要作用[12]，本研究发现VEGF在浆膜或浆膜外浸润组、淋巴结转移组、TNM Ⅲ+Ⅳ期组患者的胃癌标本中VEGF蛋白阳性率较高(P<0.05)，提示VEGF蛋白与浸润深度、淋巴结转移、TNM分期有关，可能涉及的机制包括[13]：(1)诱导内皮细胞产生基质金属蛋白酶和组织因子，促进基底膜的降解，为肿瘤细胞的转移提供条件；(2)增强血管通透性，促进血浆纤维蛋白外渗为其他细胞的迁移提供一个网络支架；(3)能够促进癌旁血管、淋巴管的生成，利于癌细胞转移。VEGF可以被Akt途径激活[4]，而HER-2及NF-κB正是Akt途径的上游调控基因，因此HER-2与VEGF、NF-κB与VEGF均具有相关性(P<0.05)，这与本实验的研究结果一致。

虽然手术与化疗使胃癌患者的生存率有所提高，但其预后仍不理想，特别是中晚期胃癌患者的5年生存率仍然很低。而通过分子靶向治疗，可以针对性的抑制肿瘤细胞生长、增殖，从而有效控制肿瘤的发展、浸润。联合检测HER-2、NF-κB、VEGF在胃癌组织中的表达，能为胃癌的分子靶向药物治疗提供客观、科学的依据，同时这些指标也可以作为判断胃癌患者预后、筛选高危转移患者的有效指标。随着对胃癌在分子水平发生发展的深入研究，逐步明确胃癌细胞信号传导网络中的重要指标或节点，针对这些重要指标或节点的多靶点联合治疗理念的实现，胃癌治疗将会进入一个精确、高效的全新境界。

[1] Shah MA,Schwartz GK.Treatment of metastatic esophagus and gastric cancer[J].Semin Oncol.2004,31(4):574-587.

[2] Ignatiadis M,Desmedt C,Sotiriou C,et al.HER-2 as a target for breast cancer therapy[J].Clin Cancer Res,2009,15(6):1 848-1 852.

[3] 文亦磊,叶星江.核因子-κB及Bcl-2在胃癌组织中的表达及意义[J].广东医学,2014,35(11):1 705-1 707.

[4] 关润年,周晓东.Akt介导VEGF信号通路在促进胃癌淋巴管新生中的作用[J].世界华人消化杂志,2012,20(7):541-545.

[5] Hofmann M,Stoss O,Shi D,et al.Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer:results from a validation study[J].Histopathology,2008,52(7):797-805.

[6] Volm M,Koomägi R,Mattern J.Prognostic value of vascular endothelial growth factor and its receptor Flt-1 in squamous cell lung cancer [J].Int J Cancer,1997,74(1):64-68.

[7] Ménard S,Tagliabue E,Campiglio M,et al.Role of HER2 gene overexpression in breast carcinoma[J].J Cell Physiol,2000,182(2):150-162.

[8] 宋 岩,黄 镜,王金万.HER2/neu基因扩增和蛋白表达与晚期胃癌患者预后的关系[J].癌症,2010,29(1):76-81.

[9] Park DI,Yun JW,Park JH,et al.HER-2/neu amplification is an independent prognostic factor in gastric cancer [J].Dig Dis Sci,2006,51(8):1 371-1 379.

[10]Makino K,Day CP,Wang SC,et al.Upregulation of IKKalpfa/IKKbeta by integrin-linked kinase is required for HER-2/neu-induced NF-kappaB antiapoptotic pathway[J].Oncogene,2004,23(54):3 883-3 887.

[11]安 杰,郭建昇.HER-2/neu和NF-κBp65在胃癌中的表达及其临床意义[J].现代肿瘤医学,2010,18(6):1 168-1 171.

[12]Bertolini F,Marighetti P,Martin-Padural I,et al.Anti-VEGF and beyond:shaping a new generation of anti-angiogenic therapies for cancer[J].Drug Discov Today,2011,16(23/24):1 052-1 060.

[13]Paganetti H.Changes in tumor cell response due to prolonged dose delivery times in fractionated radiation therapy[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,2005,63(3):892-900.

Expressions and clinical significance of human epidermal growth factor receptor-2,nuclear factor-κB and vascular endothelial growth factor in gastric carcinoma tissues

WENYi-lei1,OUHai-ling1,LAIYan-yan2,CUIJin-zhu1

(1DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530023,China;2DepartmentofGenetics,GuangxiMedicalCollege,Nanning530023,China)

Objective To investigate the expressions and clinical significance of human epidermal growth factor receptor-2(HER-2),nuclear factor-κB(NF-κB) and vascular endothelial growth factor(VEGF) in gastric carcinoma tissues.Methods The expressions of HER-2,NF-κB and VEGF proteins were detected by immunohistochemistry(S-P method) in 126 gastric carcinoma tissues and 54 normal gastric mucosa tissues.The correlation of the three proteins,and the relationship of the protein expressions with clinical and pathological characteristics of gastric carcinoma were analyzed.Results ① In gastric carcinoma tissues,the overexpression rate of HER-2 was 21.4%(27/126),the positive expression rates of NF-κB and VEGF protein were 53.9%(68/126) and 58.7%(74/126) respectively,which were significantly higher than those in normal gastric mucosa(P<0.05).② The overexpression rates of HER-2 protein in gastric carcinoma specimens were higher in the poorly differentiated gastric carcinoma group,lymphatic metastasis group and TNM stage Ⅲ+Ⅳ group(P<0.05).The positive expression rates of NF-κB protein in gastric carcinoma specimens were higher in the poorly differentiated group,serosal or subserosal infiltration group and TNM stage Ⅲ+Ⅳ group(P<0.05).The positive expression rates of VEGF protein in gastric carcinoma specimens were higher in serosal or subserosal infiltration group，lymphatic metastasis group and TNM stage Ⅲ+Ⅳ group(P<0.05).③ In gastric carcinoma tissues,the expression of HER-2 positively correlated with the expression of NF-κB or VEGF,and positive correlation also existed between NF-κB and VEGF expressions(P<0.05).Conclusion The positive expressions of HER-2,NF-κB and VEGF increase in the gastric carcinoma tissues.HER-2 can activate NF- κB to affect the development and prognosis of gastric cancer,and activate VEGF to promote the growth and metastasis of tumor.The synergistic effect of HER-2,NF-κB and VEGF has a great significance in the study of signal transduction network and molecular-targeted drug therapy for gastric cancer. 【Key words】 Gastric carcinoma,Human epidermal growth factor receptor-2,Nuclear factor-κB,Vascular endothelial growth factor,Immunohistochemistry

广西高校科学技术研究项目(LX2014175)

文亦磊(1982～)，男，博士，副主任医师，研究方向：肿瘤病理的临床、基础研究及病理教学。

R 735.2

A

0253-4304(2016)01-0031-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.01.10

2015-11-07

2015-12-25)