HBV X蛋白与非编码RNA在HBV相关性肝癌进程中相关性的研究进展

孙子军综述，何　松审校（重庆医科大学附属第二医院，重庆400010）

HBV X蛋白与非编码RNA在HBV相关性肝癌进程中相关性的研究进展

孙子军综述，何松审校（重庆医科大学附属第二医院，重庆400010）

肝炎病毒，乙型；病毒蛋白质类；肝肿瘤；RNA；综述

原发性肝细胞肝癌（HCC）是临床上最常见的恶性肿瘤之一，全球每年大约有25万新发的肝癌患者，有50万～60万人死于肝癌［1］。肝癌的形成涉及多个遗传学及分子学的改变，虽然众多的因素如酒精、滥用药物、炎症性肝病均可导致肝癌的形成，但乙型肝炎病毒（HBV）感染仍是导致肝癌形成的主要原因。全世界约有2.4亿人感染HBV，HBV是一个不完全环状双链DNA，其包含4个开放读码框（ORF），分别编码4种蛋白，即S、X、E、C蛋白。HBV中的X基因作为最小的一个ORF，编码由154个氨基酸组成，相对分子质量为17×103的蛋白HBx［2-3］，HBx参与众多重要的生物学过程，如细胞信号传递、周期进程、细胞增殖与凋亡等，在HCC的形成过程中起着重要作用。

之前普遍研究认为，基因调控主要依赖于蛋白编码的RNA，非编码RNA（ncRNAs）是细胞转录过程中的“噪声”和机体的“废物”，然而随着基因测序技术的进步，越来越认为超过90%的基因参与非编码RNA的转录，而仅有2%的基因能够编码蛋白质［4］。根据其大小，ncRNAs又可以分为2类：短链ncRNAs（small ncRNAs，sncRNAs，＜200 nt）和长链ncRNAs（long ncRNAs，lncRNAs，＞200nt）；sncRNAs包含微小 RNAs（miRNAs）、小干扰RNAs（siRNAs）及PIWI相互作用RNAs（piRNAs）。ncRNAs虽不编码蛋白质，但其在表观遗传水平、转录及转录后水平调控基因的表达，广泛参与了肝癌形成的病理生理过程。越来越多的研究证实，HBx与ncRNAs 在HCC的形成过程中相互作用、相互影响，共同参与肝癌的发生。HBx蛋白是一种多功能的调节蛋白，在细胞信号传递、HBV复制、周期进程、增殖及凋亡、蛋白降解、基因表达、表观调控和遗传稳定性等方面均有确切影响，广泛参与HBV相关性HCC的发生及恶化。近年来，随着人们对ncRNAs的深入研究，发现其在细胞周期进程、增殖及凋亡过程中同样广泛参与HCC的发展过程。本文将对HBx蛋白参与多种细胞信号通路、调控细胞周期、促进HBV复制、HCC的发生方面与ncRNAs的相关性作一综述。

1　HBx参与多种细胞信号通路，调控HBV复制

HBx作为一种多功能蛋白，广泛参与多种细胞信号通路、调控细胞周期、促进HBV复制和细胞增殖。在HBx转基因小鼠肝脏中，IL-6/STAT3和Wnt/β-catenin信号通路被激活［5］，而在大鼠原代肝脏细胞转染HBx后发现，HBx能够促进G0期的肝脏细胞进入G1期。研究者同时认为，HBx能够促进细胞由G0期进入G1期，并且阻碍细胞进入S期，与细胞中的三磷酸脱氧核糖核苷酸（dNTPs）有很大关联［6］。前期对小鼠肝脏的研究发现，HBx能够诱导p21和p27的表达，同时能够激活G1期生长捕获的MAPK信号通路，进而促进细胞周期和肝脏中HBV的复制［7］。近期研究发现，多种细胞信号通路参与了HBx促进细胞增殖过程，包括Ras/Raf/MEK/ERK、PI3K-Akt/PKB、JNK、Jak/STAT、NF-κB等［8-11］，在大鼠卵圆细胞中也发现了HBx通过激活MEK/ERK和PI3K/Akt/ PKB信号通路、上调细胞周期蛋白D1（cyclin D1）的表达、促进卵圆细胞增殖［12］。HBx激活p-ERK1/2信号通路与COX-2、5-LOX、Gi/o及PGE2、LTB4等之间的相互作用促进肝细胞增殖［13］。在原代小鼠肝脏细胞中，HBx通过下调p16表达，上调cyclin D、cyclinE、p21，使肝细胞从G0期进入G1期，并且停滞于G1期，同时HBx能够上调p21的表达拮抗内源性p53基因沉默导致的细胞周期向S期推进，从而促进HBV的复制和细胞增殖。此外，NF-κB信号通路在HBV相关的HCC形成过程中起着重要作用，有研究证实，HBx通过NF-κB信号通路诱导细胞避免抗肿瘤药物导致的细胞死亡，并伴随着抗凋亡基因的上调［11］。可见，HBx可通过多种分子机制及信号通路参与HCC的形成过程。

2　HBx对肝脏损伤后再生的影响

有研究指出，在70%肝切除的HBx转基因小鼠动物模型中，HBx表达能够抑制肝脏的再生［14］。另一项研究结果则与之相反，在70%肝切除后的HBx转基因小鼠相对于野生型小鼠细胞中p21稳定性下降，表明HBx能够促进细胞提早进入细胞周期，促进肝再生［15］。但同时也发现在转基因小鼠中，HBx的表达不会影响细胞凋亡、糖原合成及脂肪变性，对于肝再生过程中HBx推进细胞周期的具体细胞机制还不是很清楚。肝细胞生长因子（HGF）、IL-6和TNF-α［16］在肝切除后再生过程中发挥着重要的作用，HGF是肝脏再生的起始因子，IL-6能够促进MAPK信号通路，而TNF-α能够诱发IL-6表达，HBx转基因小鼠在 DDC饲喂条件下发现，IL-6/ STAT3信号表达明显增强，验证了上述说法。经典的Wnt/ β-catenin信号通路在肝再生的过程中也发挥着重要的作用［17］，HCC中β-catenin突变体极为常见，在非HBV相关性肝癌中，异位表达的Wnt-1信号不能够激活Wnt/ β-catenin信号通路，而在HBV感染引起的肝癌中，结果则相反，表明HBx对HCC中Wnt/β-catenin信号通路的激活是非常必要的［18］。在肝脏损伤后再生过程中，正常细胞会进行DNA修复，而在HBx转基因小鼠中发现，肝细胞提早由G0期进入G1期，加快细胞周期进程，从而影响DNA损伤后修复。这些研究表明，HBx可以通过干预肝脏损伤后的再生过程，进而影响肝脏的修复及HCC的发生及进程。

3　lncRNA对肝脏损伤后再生的影响

有研究发现，lncRNA-an lncRNA associated with liver regeneration（lncRNA-LALR1，lncRNA-uc008aum）广泛参与小鼠肝脏2/3切除（PH）后肝脏再生过程。在肝脏再生的过程当中，HGF上调，增加了lncRNA-LALR1的表达，且通过激活 Wnt/β-catenin信号通路，上调cyclin D1表达，加速肝细胞G1期进程，进而在体内外促进细胞周期进程和肝细胞增殖［19］。肝脏中5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）阳性指数结果表明，HBx转基因小鼠在PH后较野生组达到峰值时间短，HBx可促进肝细胞提早进入S期［15］。有研究证实，上调lncRNA-LALR1表达，在PH后肝脏再生过程中G1/S期蛋白cyclin D1、cyclin E1、cyclin A2表达升高，而下调lncRNA-LALR1表达，结果则相反［19］。更加重要的是，lncRNA-LALR1参与包括Wnt/β-catenin、MAPK等多种信号通路来调控肝脏的增殖。BNL CL.2（小鼠胚胎干细胞）中lncRNA-LALR1水平明显高于CCL-9.1（正常小鼠肝细胞系），同时2种细胞中，lncRNA-LALR1均能通过调控细胞周期促进肝细胞的增殖［4］。而在原代小鼠肝脏细胞中HBx能够促进G0/G1进程［15］，调控肝细胞增殖，同时研究发现较低水平的HBx蛋白能够激活MAPK信号通路，上调p21、p27的表达，抑制DNA的合成，而将HBx蛋白表达水平提高10倍，则发现p21、p27表达下调，G1期生长捕获作用转变为促进细胞增殖［20］。HBx蛋白在调整细胞增殖功能的复杂性是否与lncRNA-LALR1具有相关性及其可能的机制有待进一步研究。

4　sncRNAs对HBx相关性肝癌的影响

sncRNAs可以促进或抑制肿瘤生长。在肝癌中，普遍发现miR-221表达增加［21］，而HBV相关性肝癌中则发现miR-132表达下调，进一步研究则发现，在HepG2细胞中HBx通过促进miR-132甲基化进而抑制其表达［22］；与之类似，HBx能够通过上调DNA甲基转移酶3A （DNMT3A）引起miR-101异常甲基化，进而下调miR-101的表达［23］；近来研究则发现，在非肿瘤性的肝细胞中，HBx通过激活IL-6/STAT3信号通路，上调miR-21，而miR-21表达能够使非肿瘤性的肝细胞获得体外增殖和体内成瘤的能力［24］。有动物研究结果显示，HBx可通过下调p53的表达，抑制miR-148a与启动子的结合，从而使miR-148a在HBV相关肝癌中表达下降，有利于肿瘤的增殖和转移［25］。此外，近来研究提示，HBx可通过影响miR-192、miR-548p转录过程，从而使二者在HBV相关性HCC中表达下调［26-27］。这些研究表明，HBx能够调控miRNAs差异性表达，进而促进肿瘤的增殖和转移。然而，从HBV感染到肝癌的发生是一个长期的过程，在HBV感染的早期阶段，存在miRNAs参与HBx调控细胞周期进程、凋亡、增殖及DNA损伤后修复等过程，其具体的机制还需进一步研究证实。

5　lncRNA对HBx相关性肝癌的影响

最近的研究表明，lncRNA在人类疾病发展过程中同样发挥着重要的作用。通常认为lncRNA长度大于200 nt，高度不保守，调控染色体修复、转录、转录后蛋白修饰、基因组印迹及蛋白功能调节［28-29］。在细胞的增殖、分化、周期、凋亡等生物学方面同样观察到lncRNA差异性表达。在分子功能学方面，lncRNA的作用主要分为以下4类：信号、诱导、指引和支持［30］。虽然目前已经阐明了lncRNA功能的主要分子机制，但是涉及具体的lncRNA生物学功能则研究甚少［31］。lncRNA参与各种生物学功能和病理变化，研究认为，lncRNA-BACE异常表达后能够通过调节其抗原基因BACE1编码的B-secretase蛋白，进而引起阿尔茨海默病，越来越多证据表明lncRNA表达与肿瘤相关。因此，lncRNA用于临床诊断和治疗肿瘤。近年来，越来越多证据表明lncRNA的表达与肿瘤相关。例如，lncRNA-metastasis-associated lung adenocarcinoma tran-script 1（MALAT1）与乳腺癌、肺癌、前列腺癌及肝癌的发生及转移存在相关性［32］。在HCC的发生、转移、预后及诊断等方面，lncRNA的研究逐渐成为热点。例如，H19是一种公认的编码长度为2.3 kb的lncRNA，特异性表达于母性等位基因，在生物体的生长和发育过程中发挥重要作用。在HBV相关性肝癌中，发现H19通过下调上皮细胞间质化（EMT）标记物钙黏附蛋白E（E-cadherin，CDH1）、细胞角蛋白-8（cytokeratin-8，KRT-8）、cytokeratin-19（KRT-19）及紧密连接蛋白-1 （claudin-1，CLDN1）的表达，进而抑制肝癌的进程［33］。HBx作为HBV中重要的功能性调节蛋白，在肝癌的发生发展过程发挥重要作用。近来研究证实，HBx通过特异性调节肿瘤相关性lncRNA的表达促进肝癌的发生，Du等［34］在其研究中发现，在肝癌中lncRNA highly up-regulated in liver cancer（HULC）的表达水平与HBx呈正相关，进一步研究证实在肝细胞株LO2和肝癌细胞株HepG2中，HBx能够通过抑制p18，上调lncRNA-HULC的表达，进而促进肝癌细胞的增殖。研究发现，HBx能够下调lncRNA down-regulated expression by HBx（Dreh），而lncRNA-Dreh通过特异性结合波形蛋白，抑制HCC的转移［35］。Huang等［36］发现一种新型与HBx相关的lncRNA DBH-AS1，检测组织中lncRNA DBH-AS1的表达水平，提示其乙型肝炎表面抗原（HBsAg）及肿瘤组织大小呈正相关，进一步研究发现，IncRNA DBH-AS1的过量表达可诱导细胞周期G1/S和G2/M加速，其结果表明，HBx可诱导lncRNA DBH-AS1的表达，并且通过激活MAPK通路促进肝癌细胞的增殖和存活。HBx能够特异性调控lncRNA，促进肝癌发生及转移。然而，人体内HBV慢性感染往往迁延数十年，因此作者有理由相信在肝癌发生前，HBx已经通过调控lncRNA参与肝细胞恶化的各个过程，包括改变肝细胞正常的周期、增殖、凋亡等，最终发展为肝癌。

综上所述，HBx能够调控肝脏中多种ncRNAs的表达，同时也有多种ncRNAs参与HBx蛋白调控的肝脏周期、增殖及肝癌的形成过程，但现在对于HBx与ncRNAs二者之间具体的作用机制还不是很清楚，还有待进一步研究。

［1］段昌虎，邰升.HBx与肝细胞癌发病机制的研究进展［J］.世界华人消化杂志，2013，21（24）：2397-2402.

［2］Geng M，Xin X，Bi LQ，et al.Molecular mechanism of hepatitis B virus X protein function in hepatocarcinogenesis［J］.World J Gastroenterol，2015，21（38）：10732-10738.

［3］Bouchard MJ，Schneider RJ.The enigmatic X gene of hepatitis B virus［J］. J Virol，2004，78（23）：12725-12734.

［4］Esteller M.Non-coding RNAs in human disease［J］.Nat Rev Genet，2011，12（12）：861-874.

［5］Wang C，Yang W，Yan HX，et al.Hepatitis B virus X（HBx）induces tumorigenicity of hepatic progenitor cells in 3，5-diethoxycarbonyl-1，4-dihydrocollidine-treated HBx transgenic mice［J］.Hepatology，2012，55（1）：108-120.

［6］Gearhart TL，Bouchard MJ.The hepatitis B virus X protein modulates hepatocyte proliferation pathways to stimulate viral replication［J］.J Virol，2010，84（6）：2675-2686.

［7］Qiao L，Leach K，McKinstry R，et al.Hepatitis B virus X protein increases expression of p21（Cip-1/WAF1/MDA6）and p27（Kip-1）in primary mouse hepatocytes，leading to reduced cell cycle progression［J］.Hepatology，2001，34（5）：906-917.

［8］Tang RX，Kong FY，Fan BF，et al.HBx activates FasL and mediates HepG2cell apoptosis through MLK3-MKK7-JNKs signal module［J］.World J Gastroenterol，2012，18（13）：1485-14895.

［9］Park YH，Shin HJ，Kim SU，et al.iNOS promotes HBx-induced hepatocellular carcinoma via upregulation of JNK activation［J］.Biochem Biophys Res Commun，2013，435（2）：244-249.

［10］Sze KM，Chu GK，Lee JM，et al.C-terminal truncated hepatitis B virus X protein is associated with metastasis and enhances invasiveness by C-Jun/ matrix metalloproteinase protein 10 activation in hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2013，57（1）：131-139.

［11］Liu Y，Lou G，Wu W，et al．Involvement of the NF-kappa B pathway in multidrug resistance induced by HBx in a hepatomacell line［J］．J Viral Hepat，2011，18（10）：e439-446.

［12］Wang HY，Yang SL，Liang HF，et al.HBx protein promotes oval cell proliferation by up-regulation of cyclin D1 via activation of the MEK/ERK and PI3K/Akt pathways［J］.Int J Mol Sci，2014，15（3）：3507-3518.

［13］Shan C，Xu F，Zhang S，et al.Hepatitis B virus X protein promotes liver cell proliferation via a positive cascade loop involving arachidonic acid metabolism and p-ERK1/2［J］.Cell Res，2010，20（5）：563-575.

［14］Wu BK，Li CC，Chen HJ，et al.Blocking of G1/S transition and cell death in the regenerating liver of Hepatitis B virus X protein transgenic mice［J］. Biochem Biophys Res Commun，2006，340（3）：916-928.

［15］Hodgson AJ，Keasler VV，Slagle BL.Premature cell cycle entry induced by hepatitis B virus regulatory HBx protein during compensatory liver regeneration［J］.Cancer Res，2008，68（24）：10341-10348.

［16］Michalopoulos GK.Liver regeneration［J］.J Cell Physiol，2007，213（2）：286-300.

［17］Xu D，Yang F，Yuan JH，et al.Long noncoding RNAs associated with liver regeneration 1 accelerates hepatocyte proliferation during liver regeneration by activating Wnt/β-catenin signaling［J］.Hepatology，2013，58（2）：739-751.

［18］Cha MY，Kim CM，Park YM，et al.Hepatitis B virus X protein is essential for the activation of Wnt/beta-catenin signaling in hepatoma cells［J］. Hepatology，2004，39（6）：1683-1693.

［19］Xu D，Yang F，Yuan JH，et al.Long noncoding RNAs associated with liver regeneration 1 accelerates hepatocyte proliferation during liver regeneration by activating Wnt/β-catenin signaling［J］.Hepatology，2013，58（2）：739-751.

［20］Qiao L，Leach K，McKinstry R，et al.Hepatitis B virus X protein increases expression of p21（Cip-1/WAF1/MDA6）and p27（Kip-1）in primary mouse hepatocytes，leading to reduced cell cycle progression［J］.Hepatology，2001，34（5）：906-917.

［21］Pineau P，Volinia S，McJunkin K，et al.miR-221 overexpression contributes to liver tumorigenesis［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（1）：264-269.

［22］Wei X，Tan C，Tang C，et al.Epigenetic repression of miR-132 expression by the hepatitis B virus X protein in hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma［J］.Cell Signal，2013，25（5）：1037-1043.

［23］Wei X，Xiang T，Ren G，et al.miR-101 is down-regulated by the hepatitis B virus X protein and induces aberrant DNA methylation by targeting DNA methyltransferase 3A［J］.Cell Signal，2013，25（2）：439-446.

［24］Li CH，Xu F，Chow S，et al.Hepatitis B virus X protein promotes hepatocellular carcinoma transformation through interleukin-6 activation of micro-RNA-21 expression［J］.Eur J Cancer，2014，50（15）：2560-2569.

［25］Xu X，Fan Z，Kang L，et al.Hepatitis B virus X protein represses miRNA-148a to enhance tumorigenesis［J］.J Clin Invest，2013，123：630-645.

［26］Gao F，Sun X，Wang L，et al.Downregulation of microRNA-145 caused by hepatitis B virus X protein promotes expression of CUL5 and contributes to pathogenesis of hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma［J］.Cell Physiol Biochem，2015，37（4）：1547-1559.

［27］Hu XM，Yan XH.MicroRNA-548p suppresses hepatitis B virus X protein associated hepatocellular carcinoma by downregulating oncoprotein HBXIP［J］.Hepatol Res，2015，11（19）：12618-12630.

［28］Kung JT，Colognori D，Lee JT.Long noncoding RNAs：past，present，and future［J］.Genetics，2013，193（3）：651-669.

［29］Cheetham SW，Gruhl F，Mattick JS et al.Long noncoding RNAs and the genetics of cancer［J］.Br J Cancer，2013，108（12）：2419-2425.

［30］He Y，Meng XM，Huang C，et al.Long noncoding RNAs：novel insights into hepatocelluar carcinoma［J］.Cancer Lett，2014，344（1）：20-27.

［31］Maruyama R，Suzuki H.Long noncoding RNA involvement in cancer［J］. BMB Rep，2012，45（11）：604-611.

［32］Ji P，Diederichs S，Wang W，et al.MALAT-1，a novel noncoding RNA，and t hymosin beta4 predict metastasis and survival in early-stage nonsmall cell lung cancer［J］.Oncogene，2003，22（39）：8031-8041.

［33］Zhang L，Yang F，Yuan JH，et al.Epigenetic activation of the miR-200 family contributes to H19-mediated metastasis suppression in hepatocellular carcinoma［J］.Carcinogenesis，2013，34（3）：577-586.

［34］Du Y，Kong G，You X，et al.Elevation of highly up-regulated in liver cancer （HULC）by hepatitis B virus X protein promotes hepatoma cell proliferation via down-regulating p18［J］.J Biol Chem，2012，287（31）：26302-26311.

［35］Huang JF，Guo YJ，Zhao CX，et al.Hepatitis B virus X protein（HBx）-related long noncoding RNA（lncRNA）down-regulated expression by HBx （Dreh）inhibits hepatocellular carcinoma metastasis by targeting the intermediate filament protein vimentin［J］.Hepatology，2013，57（5）：1882-1892.

［36］Huang JL，Ren TY，Cao SW，et al.HBx-related long non-coding RNA DBH-AS1 promotes cell proliferation and survival by activating MAPK signaling in hepatocellular carcinoma［J］.Oncotarget，2015，6（32）：33791-33804.

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.14.019

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1009-5519（2016）14-2169-04

（2016-02-01）