荧光定量PCR在结核菌快速检测中的应用分析

杜安玲

(安阳市结核病防治所　河南 安阳　455000)



荧光定量PCR在结核菌快速检测中的应用分析

杜安玲

(安阳市结核病防治所河南 安阳455000)

目的探讨荧光定量PCR在结核菌快速检测中的应用效果。方法选取安阳市结核病防治所2014年6月至2014年12月就诊的100例呼吸系统疾病患者(临床阳性痰分离株100份)，应用荧光定量PCR技术检测。结果荧光定量PCR检测准确率为97%，菌种鉴定特异性实验符合率为100%。结论结核菌快速培养法如荧光定量PCR技术经济、简单，结果可靠，特异度和敏感性均居较高水平，鉴别诊断能力较强，实验室可据自体条件对不同的检测方法进行选择。

结核菌；荧光定量PCR；快速检测

近年来，受多种因素影响，结核病发病率有上升表现，我国属结核病高负担国家，对公众生命安全构成了严重影响。结核病快速检测可为诊治提供依据，是加强防控效果的关键[1]。本次选取相关病例，依据需要，应用荧光定量PCR检测，现将相关内容总结如下。

1　资料与方法

1.1一般资料选取安阳市结核病防治所2014年6月至2014年12月就诊的100例呼吸系统疾病患者(痰液标本阳性)，年龄20～60岁，平均(45.2±5.8)岁，男62例，女38例。

1.2检测方法应用荧光定量PCR试剂盒(美国原装进口)和荧光定量PCR仪；取受试对象清晨痰液，以等体积的NaOH(4%)加入，在室温下液化30 min，若溶液仍黏稠，取出部分痰液，再取4倍体积NaOH(4%)加入；在生物安全柜内将液化标本取出1 ml左右，12 000 r/min离心5 min，弃上清，重复操作，加入核酸提取液50 μl，混匀，使沉淀物悬浮，100 ℃置样管10 min，后放置4 ℃环境下冷却，离心2 min，吸取上清，将反应模板保存在4 ℃环境中。依据PCR反应体系配置，设置测试循环，94 ℃、2 min，94℃、15 s，72 ℃、40 s，55 ℃、15 s，共40个循环，在实验前调整增益值，完成扩增程序。

1.3观察指标统计PCR检测结果，并计算其准确率和特异性实验符合率。

2　结果

荧光定量PCR检测准确率为97%，菌种鉴定特异性实验符合率为100%。

3　讨论

传统结核杆菌培养方法时间较长，为2～3个月，增加了防控、治疗药物选择、结核病诊断的难度。在世界范围内，快速诊断结核病的方法均已成为关注的焦点，快速诊断技术近年的研发和应用也为耐药结核和不典型结核诊治提供了较大帮助，本文就快速检测结核菌及耐药菌技术加以探讨。

结核杆菌培养方法： ①液体培养法：在液体培养基中，结核杆菌生长速度较快，设备、方法均较简单，故在中低收入国家，WHO推荐应用此方法完成相关检验。如分枝杆菌快速手工培养，不管对一或二线药物，行药敏测试均有效、精确、简单。检测异烟肼和利福平敏感性的准确率在90%以下，结果7～14 d即获得[2]。应用MGIT960自动培养系统，其工作原理与分枝杆菌快速手工培养相同，但荧光信号读取和培养由仪器按事先设计程序自动控制。对此系统测定结果荟萃分析，预测值和精确性均居较高水平，用二线药敏试验，结果与放射测量法一致[3]。此方法检测氧氟沙星特异性和敏感性均达100%，效果较理想，但设备需资金，仪器最大工作负荷对样品量有所限制，在小规模实验室中适合应用。具体技术：a.The BacT/Alert 3D系统，应用改良肉汤培养基(7H9 Middlebrook)，取比色传感器装在试管底部，能感受细菌代谢产生的CO2，由绿向黄色转换，仪器对颜色变化自动持续监测。此系统在结核菌快速培养中有较好的药敏检测特异度和灵敏度。b.The Versa TREK系统，应用肉汤培养基(富含7H9 Middlebrook)，细菌代谢在一定程度上使培养容器内压力出现变化，可监测压力变化和细菌生长情况，在同一装置内完成培养和检测。c.显微镜对肉汤-药敏观察测试，结核杆菌生长过程中有特征性的绳带形成，在24孔板中用液体培养基(含或不含抗生素)对细菌培养，应用倒置显微镜对结核菌特征性Cord相关形成情况用40倍镜头观察。对MODS测试异烟肼和利福平的敏感性荟萃分析，涂阳痰标本特异性为96%，结果在平均21 d时即100%得出，操作较为简单。d.比色氧化还原指标剂法，在培养基(含或不含抗结核药)中放置氧化还原指示剂，培养基颜色在细菌生长时有改变，对两管培养的颜色对比，可对结核菌是否耐药进行判断。对耐药性监测进行荟萃分析表明，特异性和敏感性均居较高水平。临床有多种氧化还原指示剂，可依据不同药物对相对敏感的指示器进行选择。e.载玻片培养技术，在载玻片培养基础上加强改进的一种新型快速培养技术，在灭菌载玻片一端将10个样品涂片纵切成两半，放入培养瓶(7 ml液体培养基)，取不含抗结核药的3瓶作对照，其他瓶做药敏试验(含抗结核药)，在冰箱中过夜，将培养瓶在次日由培养箱中移入，培养10 d。载玻片取出后干燥，染色，显微镜下观察抗酸菌落。当对照组菌落最少有1个，药敏组仍有菌落时，即产生耐药。此法对利福平的精确度为96%，对异烟肼的精确度为90%。此方法原理较为简单，但操作复杂。②固定培养措施：a.TK培养基结核菌快速培养系统，结核杆菌代谢活动可促使培养基色泽发生改变，可在形成细菌菌落前依据培养基颜色对分枝杆菌是否生长加以鉴定。方法经济、简单，出结果时间较常规培养缩短10 d。该技术可排除常见细菌污染，对非结核与结核分枝杆菌进行鉴别，完善质量控制，规范应用条件，为一种有前途、实用的措施。b.噬菌体法，采用噬菌体生物扩增法快速检测结核菌，对基本原理进行分析，在含结核分枝杆菌待测样品中引入特异性裂解分枝杆菌噬菌体，噬菌体能感染活分枝杆菌，多余的未进入菌体的噬菌体加入消毒剂中灭活，已入菌体内的噬菌体未受相关影响[4]。在受感染分枝杆菌内，噬菌体大量繁殖并裂解菌体，有大量子代噬菌体释放，可感染随后加入的相关指示细胞并对其裂解，观察琼脂平板培养基，有透明噬菌斑出现。依据噬菌斑数量对标本中有无活结核分枝杆菌进行判断[4]。

本研究应用DNA探针对临床标本直接鉴定，可对鸟结核分枝杆菌、复合结核杆菌进行辨别，结果示，荧定量PCR检测准确率为97%，菌种鉴定特异性实验符合率为100%。

综上，结核菌快速培养法经济、简单，结果可靠，但获取结果时间仍需10～20 d。核酸扩增1～2 d或几小时均可得到结果，有较高的特异度和敏感性，鉴别诊断能力较强，实验室可仍据自体条件对不同的检测方法进行选择。

[1]周华.耐药结核菌检测技术的国内研究进展[J].贵州医药,2012,36(3):279-280.

[2]张西雁,张春智,陈刚,等.依赖利福平结核菌肺结核一例分析[J].中华传染病杂志,2008,26(2):110-111.

[3]张娟,孙炳奇,孙娇,等.两种基因诊断技术对结核分枝杆菌耐药性检测效果比较[J].实用医学杂志,2014,30(9):1482-1485.

[4]赵丽,赵绪永,陈红英,等.PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2012,40(5):19-23.

R 446.5doi: 10.3969/j.issn.1004-437X.2016.09.094

2015-12-27)