绿色化学方法合成儿茶酚-壳聚糖水凝胶的应用

陈 曦,俞明珠,刘 剑,杨 柳,韩守法(厦门大学化学化工学院,福建厦门361005)



绿色化学方法合成儿茶酚-壳聚糖水凝胶的应用

陈 曦,俞明珠,刘 剑,杨 柳*,韩守法*
(厦门大学化学化工学院,福建厦门361005)

摘要:水凝胶在生物医学领域有重要应用价值,如促进伤口愈合等.利用壳聚糖与2,4,5-三羟基苯甲醛或2,3,4-三羟基苯甲醛通过一步环境友好、副产物为水的生成希夫(Schiff)碱的反应,得到一类壳聚糖-儿茶酚类的水凝胶应用于伤口处理.2,4,5-三羟基苯甲醛修饰的壳聚糖水凝胶(CC-1)能有效抑制金黄色葡萄球菌生长,而2,3,4-三羟基苯甲醛修饰的壳聚糖水凝胶(CC-2)具有极强的黏附性.在小鼠模型上,CC-1促进开放性伤口愈合的效果与商品化药膏(DuoDERM)相当.与文献报道的以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基二亚胺(EDC)缩合法合成的水凝胶相比,本研究在制备CC-1或CC-2的过程中不需要加入额外的化学试剂,终产物只有水凝胶和水,无需纯化,安全无毒,即配即用.

关键词:壳聚糖;儿茶酚;水凝胶;生物黏附

伤口的愈合过程经历4个阶段:急性炎症期、细胞增殖期、瘢痕形成期、表皮及其他组织再生期[1].在伤口愈合过程中,成纤维细胞大量增殖,在伤口底部及边缘生长出肉芽组织,通过分泌胶原蛋白和纤维连接蛋白来促进伤口的收缩[2-3].伤口中的血液和渗出液中的纤维蛋白原很快凝固形成凝块,有的凝块表面干燥形成痂皮,起着保护伤口的作用[4].已有研究表明,水凝胶因其物理状态及其含水量高的特性成为促进伤口愈合的理想型生物材料,不仅有助于吸收伤口组织的渗出液,还可以防止伤口因蒸发和脱水产生水分损失,从而为促进伤口愈合提供了一个理想的环境[5-6].虽然水凝胶被认为是伤口处理的理想材料,但是目前所发展的水凝胶有诸多问题,如机械强度差、溶解性不佳及细胞毒性高等,限制了它的应用发展[7-9].

壳聚糖生物相容性高,可生物降解,具有止血和抗感染等特性[10-11],且可以刺激巨噬细胞产生生长因子,产生伤口愈合所需的外环境[12-13],促进成纤维细胞的增殖,从而使伤口加速愈合;然而在p H中性的水溶液中溶解度很差,这在一定程度上限制了它的应用[2,14-17].目前提高壳聚糖水溶性的方法都有一些局限性:降低壳聚糖的分子质量可以有效提高它的溶解性[18-19],但是会导致壳聚糖某些特性的丧失[20];另有研究报道[21-23],通过化学修饰可提高壳聚糖溶解性,主要是针对壳聚糖氨基这个反应位点进行化学修饰,通过接入亲水性基团如聚乙二醇(PEG),修饰过PEG的壳聚糖在水中的溶解性确实得到了很大的改善,但是由于PEG的空间位阻较大,会掩盖壳聚糖的一些活性位点,使壳聚糖失去一些固有特性,如抑菌性.

海洋软体动物海虹(mussel)能够表达一类具有强烈黏附性的蛋白,该类蛋白含有一种特殊的氨基酸(3,4-dihydroxytyrosine)[24],它能够使得海虹在海水中紧紧吸附在岩石、木头、轮船底部等不同的地方[25].有文献报道,将这类邻苯二酚(儿茶酚)类化合物修饰在壳聚糖上,能极大地增加壳聚糖的水溶性[26].与大分子(如PEG)修饰的区别是:儿茶酚类化合物体积小,可以降低其空间位阻效应,不阻挡壳聚糖与细胞或细菌的结合位点;更重要的是,由于儿茶酚类化合物所特有的黏附性,能使修饰后的壳聚糖形成水凝胶[27].目前多数文献报道,将儿茶酚类化合物修饰到高分子材料上主要是通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基二亚胺(EDC)缩合法[27-28],但该反应时间较长,且反应结束后需要对材料进行纯化.

基于水凝胶在生物医学领域的重要应用价值(如促进伤口愈合)及壳聚糖本身所特有的止血与抑菌作用,本文利用壳聚糖与儿茶酚类衍生物(2,4,5-三羟基苯甲醛或2,3,4-三羟基苯甲醛)通过一步环境友好、副产物为水的生成希夫(Schiff)碱的反应,得到一类可用于伤口处理的壳聚糖-儿茶酚类的水凝胶.与基于EDC缩合法合成的水凝胶相比,我们在制备的过程中不需要加入额外的化学试剂,终产物只有水凝胶和水,无需纯化,安全无毒,即配即用.

1 实验部分

1.1试 剂

壳聚糖(Sigma试剂公司),2,3,4-三羟基苯甲醛(Keddia试剂公司),2,4,5-三羟基苯甲醛(TCI试剂公司),醋酸(CH3COOH)和二甲基亚砜(DMSO)(国药集团化学试剂有限公司),胰酶、小牛血清、双抗、Dulbecco's modified eagle medium(DMEM)高糖培养基和噻唑蓝(MTT)(Hyclone公司),蛋白胨、酵母提取物和琼脂(BIO BASIC公司),所有试剂均为分析纯,未经特殊说明均未经过特别处理;金黄色葡萄球菌和Hela细胞为ATCC公司提供;测试所用水均为超纯水(18.2 MΩ·cm).

1.2仪 器

傅里叶变换红外光谱(FT-IR)仪:Nicolet Avatar 360;核磁共振(NMR)仪:Bruker AV 400;拉力测试仪: Instron 3343;酶标仪(吸光度分析):SpectraMax M5.

1.3材料的合成

称取10.0 g壳聚糖置于50 m L圆底烧瓶中,然后向反应瓶中加入含有0.3%(体积分数)醋酸的水溶液10 m L,搅拌使壳聚糖充分溶解,再向反应瓶中分别加入33.33 mg的2,4,5-三羟基苯甲醛和2,3,4-三羟基苯甲醛,反应体系在室温(RT)下搅拌1 h,反应完成得到淡黄色黏稠液体,即为产物2,4,5-三羟基苯甲醛-壳聚糖(CC-1)和2,3,4-三羟基苯甲醛-壳聚糖(CC-2)(图1).

1.4分析测试

FT-IR表征:使用Nicolet Avatar 360 FT-IR仪.

NMR表征:使用Bruker AV400 NMR仪,以氘水(D2O)为溶剂,四甲基硅烷(TMS)为内标进行NMR一维氢谱(1H-NMR)表征.

黏接强度的测定:使用Instron 3343拉力测试仪,被黏材料为新鲜猪皮,黏接区域约为25 mm×25 mm(以实际黏接面积为准),涂胶厚度约为0.5 mm.

细胞毒性实验(MTT实验):HeLa细胞用DMEM高糖培养液进行培养,其中加入10%(体积分数)的牛胎血清(FBS)和1% (体积分数)的抗生素(青霉素和链霉素各100 U/m L).将细胞消化后分别分到96孔板中,过夜培养后分别用小分子2,3,4-三羟基苯甲醛及2,4,5-三羟基苯甲醛培养48 h.接着用0.25 mg/m L的MTT孵育细胞4 h以生成蓝紫色结晶甲臜,轻轻吸去孔中液体后每孔用100μL DMSO溶解结晶物,震摇5 min后用Spectra Max M5酶标仪测定490 nm处的吸光度.

图1　CC-1(a)和CC-2(b)的合成路线Fig.1 The synthetic process of CC-1(a)and CC-2(b)

抑菌实验:金黄色葡萄球菌的单克隆体用Luria-Bertani(LB)液体培养基过夜培养后,离心收集菌体,稀释至在600 nm处的吸光度为1;空白组为细菌在不加任何试剂的LB液体培养基培养8 h,3个对照组分别为细菌在含有壳聚糖、CC-1和CC-2的LB液体培养基培养8 h后,将菌液稀释1×104倍,分别涂布在LB固体培养基上过夜培养.

小鼠实验:取12只昆明白小鼠分为4组,每组3 只,在所有小鼠左侧背部用打孔器(直径1 cm)造伤口模型,伤口每日分别涂CC-1、CC-2、商品药(DuoDERM,美国施贵宝公司)、磷酸盐缓冲液(PBS),观察伤口愈合情况.

2 结果与讨论

2.1反应物量比例的优化

为探索生成水凝胶时壳聚糖与2,4,5-三羟基苯甲醛或2,3,4-三羟基苯甲醛反应量的最合适比例,分别按质量比为6∶5,6∶4,6∶3.5,6∶3,6∶2.5,6∶2在上述条件中进行反应.如图2(a)所示,以任一比例修饰的2,3,4-三羟基苯甲醛的壳聚糖在4 h后均形成水凝胶. 图2(b)中,2,4,5-三羟基苯甲醛修饰的壳聚糖成胶速度较慢,在相同时间内只有质量比为6∶5和6∶4的成水凝胶状,但过夜后,任一比例修饰的2,4,5-三羟基苯甲醛的壳聚糖均形成水凝胶.该课题设计的最终目的是希望将其用于伤口的处理,所以原则上希望该水凝胶含有尽可能多的壳聚糖且始终使其壳聚糖能有更多裸露的氨基使其带正电(壳聚糖的正电性是其抑制细菌生长的原理[29]),因此我们选用质量比为6∶2来反应生成水凝胶CC-1和CC-2,后续实验所用的水凝胶均以该比例合成得到.

2.2合成产物表征

2.2.1FT-IR表征

将合成的CC-1和CC-2冻干,使用溴化钾压片法进行FT-IR测定.图3所示分别为CC-1和CC-2的谱图.根据红外光谱学的波峰分布,烯胺键在1 630～ 1 690 cm-1有较强吸收,CC-1和CC-2分别在1 650 cm-1和1 659 cm-1有吸收峰,因此可以初步断定反应生成了壳聚糖水凝胶CC-1和CC-2.

2.2.2NMR表征

图4(a)为壳聚糖的1H-NMR谱图,图4(b)和图4(c)分别为所合成壳聚糖水凝胶CC-1和CC-2 的1H-NMR谱图及其各质子的谱峰归属.图4(b)中, δ=9.44左右的峰表示反应生成了烯胺键上的质子峰,δ=6.5～7.5的峰对应2,4,5-三羟基苯甲醛的苯环上的2个质子峰.图4(c)中,δ=9.76左右的峰表示反应生成了烯胺键上的质子峰,δ=9.57左右的峰表示2,3,4-三羟基苯甲醛2位处的羟基与氮形成氢键的峰,说明所形成的壳聚糖水凝胶具有一定的稳定性;δ=6.5～7.5的峰对应2,3,4-三羟基苯甲醛的苯环上的2个氢和2个羟基氢的质子峰.通过1H-NMR谱图分析,证明壳聚糖与2,4,5-三羟基苯甲醛和2,3,4-三羟基苯甲醛反应生成了壳聚糖水凝胶高分子.

图2　反应物量比例的优化Fig.2 The optimization of amount of reactant proportion

图3　CC-1和CC-2的FT-IR谱图Fig.3 FT-IR spectra of CC-1 and CC-2

2.3黏附性实验

将2块一样大小的猪皮(25 cm×40 cm),均匀涂抹上CC-2(10 mg/m L),厚约为0.5 mm,黏贴在一起4 h后测其拉力,最大值可达70 k Pa,证明CC-2具有一定的黏附性.根据相同的方法测CC-1的黏附力,发现其在4 h内不能将两块猪皮黏合到一起,黏合性能较差.由此可见,CC-1与CC-2中羟基位置的细微差别会导致二者在黏附性能上的巨大差异.

图4　壳聚糖(a)及其水凝胶CC-1(b)和CC-2(c)的1H-NMR谱图Fig.41H-NMR spectra of chitosan(a), CC-1(b)and CC-2(c)

2.4MTT实验

壳聚糖水凝胶最终希望能够用于对活体伤口的处理,因此对材料的毒性进行评估是必要的.将He La细胞在不同质量浓度(10,50,100μg/m L)的2,4,5-三羟基苯甲醛或2,3,4-三羟基苯甲醛中孵育48 h,用MTT实验检测细胞存活情况.如图5(a)所示,2,4,5-三羟基苯甲醛与细胞的生物相容性好,即使在100 μg/m L的条件下细胞存活率也能达到65%,说明该分子没有特别明显的细胞毒性;如图5(b)所示,2,3,4-三羟基苯甲醛毒性较大,在50μg/m L时,细胞存活率仅有30%.所以,由2,4,5-三羟基苯甲醛所修饰的壳聚糖水凝胶(CC-1)更适用于活体的伤口处理.

2.5对金黄色葡萄球菌的抑制作用

金黄色葡萄球菌是常见的容易引起伤口感染的

细菌,为考察CC-1和CC-2对其的抑制作用,将用LB液体培养基培养的金黄色葡萄球菌分为4组:空白组只加PBS,实验组分别加入壳聚糖、CC-1和CC-2,终质量浓度为1 mg/m L.各组在37℃、220 r/min摇床摇菌8 h后,稀释1×104倍涂板,在培养箱培养过夜.从图7可以看出,CC-1组的细菌明显少于其余3组,说明CC-1具有一定的抑制金黄色葡萄球菌生长的作用.

图5　细胞毒性试验Fig.5 Cytotoxicity test

图6　在金黄色葡萄球菌的生长液中分别加入PBS(a)、壳聚糖(b)、CC-1(c)、CC-2(d)对其生长状况的影响Fig.6 Influence of the growth of Staphylococcus aureus treated with PBS(a),chitosan(b),CC-1(c)and CC-2(d)

2.6活体实验

为验证水凝胶对伤口的愈合作用,创建了4组小鼠伤口模型.将4组小鼠的左侧背部用打孔机各打出直径1 cm的圆形伤口,之后每天分别在4组小鼠的伤口上涂抹CC-1、CC-2、商品药(DuoDERM)以及PBS,观察小鼠伤口愈合的的情况,并在0,3,7,14 d拍照.如图7所示,涂抹CC-1的小鼠切口皮肤愈合与涂抹商品药的小鼠皮肤愈合速度最快,涂抹PBS的对照组小鼠伤口愈合最慢.4组小鼠均没有伤口感染的情况.实验证明CC-1对伤口的治疗具有较好的疗效.

图7　分别涂抹CC-1、CC-2、DuoDERM以及PBS的伤口图片Fig.7 Photographs of wounds treated with CC-1,CC-2,DuoDERM and PBS

3 结 论

本文设计并合成了一类具有黏附性的儿茶酚类修饰的壳聚糖水凝胶CC-1和CC-2,可以用于伤口处理.2,3,4-三羟基苯甲醛或2,4,5-三羟基苯甲醛与壳聚糖上的氨基反应形成烯胺键,合成原料易得,仅需一步反应,反应时间快,且反应副产物仅有水,可以即配即用.CC-2具有较强黏附性;而CC-1对金黄色葡萄球菌的生长有一定抑制作用.在小鼠的伤口模型中,使用CC-1处理伤口与用商品化药膏处理效果相当,证明CC-1对伤口有较好的治疗作用.

参考文献:

[1] GURTNER G C,WERNER S,BARRANDON Y,et al. Wound repair and regeneration[J].Nature,2008,453 (7193):314-321.

[2] CHEN R N,WANG G M,CHEN C H,et al. Development of N,O-(carboxymethyl)chitosan/collagen matrixes as a wound dressing[J].Biomacromolecules, 2006,7(4):1058-1064.

[3] UENO H,MORI T,FUJINAGA T.Topical formulations and wound healing applications of chitosan[J].Advanced Drug Delivery Reviews,2001,52(2):105-115.

[4] MCGANN C,KIICK K.Heparin-functionalized materials in tissue engineering applications[M]∥SUJATA K B. Engineering biomaterials for regenerative medicine.New York:Springer,2012:225-250.

[5] BAO P,KODRA A,TOMICCANIC M,et al.The role of vascular endothelial growth factor in wound healing[J]. Journal of Surgical Research,2009,153(2):347-358.

[6] MURAKAMI K,AOKI H,NAKAMURA S,et al.Hydrogel blends of chitin/chitosan,fucoidan and alginate as healing-impaired wound dressings [J].Biomaterials, 2010,31(1):83-90.

[7] JIN R,HIEMSTRA C,ZHONG Z,et al.Enzymemediated fast in situ formation of hydrogels from dextran-tyramine conjugates[J].Biomaterials,2007,28 (18):2791-2800.

[8] JABBARI E.Bioconjugation of hydrogels for tissue engineering[J].Current Opinion in Biotechnology,2011,22 (5):655-660.

[9] PARK K M,SHIN Y M,JOUNG Y K,et al.In situ forming hydrogels based on tyramine conjugated 4-Arm-PPO-PEO via enzymatic oxidative reaction[J].Biomacromolecules,2010,11(3):706-712.

[10] KIM I Y,SEO S J,MOON H S,et al.Chitosan and its derivatives for tissue engineering applications[J].Biotechnology Advances,2008,26(1):1-21.

[11] NOEL S P,COURTNEY H,BUMGARDNER J D,et al.Chitosan films:a potential local drug delivery system for antibiotics[J].Clinical Orthopaedics and Related Research,2008,466(6):1377-1382.

[12] GOODAY G W.Physiology of microbial degradation of chitin and chitosan[M]∥RATLEDGE C.Biochemistry of microbial degradation.Netherlands:Kluwer Academic Publishers,1994:279-312.

[13] UENO H,NAKAMURA F,MURAKAMI M,et al.E-valuation effects of chitosan for the extracellular matrix production by fibroblasts and the growth factors production by macrophages[J].Biomaterials,2001,22(15): 2125-2130.

[14] RIBEIRO M P,ESPIGA A,SILVA D,et al. Development of a new chitosan hydrogel for wound dressing[J].Wound Repair and Regeneration,2009,17 (6):817-824.

[15] KEAN T,THANOU M.Biodegradation,biodistribution and toxicity of chitosan[J].Advanced Drug Delivery Reviews,2010,62(1):3-11.

[16] ZAHAROFF D A,ROGERS C J,HANCE K W,et al. Chitosan solution enhances both humoral and cell-mediated immune responses to subcutaneous vaccination[J]. Vaccine,2007,25(11):2085-2094.

[17] LI P,POON Y F,LI W,et al.A polycationic antimicrobial and biocompatible hydrogel with microbe membrane suctioning ability[J].Nature Materials, 2011,10(2):149-156.

[18] LU S,SONG X,CAO D,et al.Preparation of water-soluble chitosan[J].Journal of Applied Polymer Science, 2004,91(6):3497-3503.

[19] PILLAI C,PAUL W,SHARMA C P.Chitin and chitosan polymers:chemistry,solubility and fiber formation[J].Progress in Polymer Science,2009,34(7): 641-678.

[20] NO H K,PARK N Y,LEE S H,et al.Antibacterial activity of chitosans and chitosan oligomers with different molecular weights[J].International Journal of Food Microbiology,2002,74(1):65-72.

[21] DU J,HSIEH Y L.PEGylation of chitosan for improved solubility and fiber formation via electrospinning[J]. Cellulose,2007,14(6):543-552.

[22] JEONG Y I,KIM D G,JANG M K,et al.Preparation and spectroscopic characterization of methoxy poly(ethylene glycol)-grafted water-soluble chitosan[J].Carbohydrate Research,2008,343(2):282-289.

[23] MAO S,SHUAI X,UNGER F,et al.Synthesis,characterization and cytotoxicity of poly(ethylene glycol)-graft-trimethyl chitosan block copolymers[J].Biomaterials,2005,26(32):6343-6356.

[24] LEE H,DELLATORE S M,MILLER W M,et al. Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings[J].Science,2007,318(5849):426-430.

[25] WAITE J H,TANZER M L.Polyphenolic substance of Mytilus edulis:novel adhesive containing L-dopa and hydroxyproline [J].Science,1981,212 (4498): 1038-1040.

[26] CHUNG Y C,KUO C L,CHEN C C.Preparation and important functional properties of water-soluble chitosan produced through Maillard reaction [J].Bioresource Technology,2005,96(13):1473-1482.

[27] KIM K,RYU J H,LEE D Y,et al.Bio-inspired catechol conjugation converts water-insoluble chitosan into a highly water-soluble,adhesive chitosan derivative for hydrogels and Lb L assembly[J].Biomaterials Science, 2013,1(7):783.

[28] HONG S,YANG K,KANG B,et al.Hyaluronic acid catechol:a biopolymer exhibiting a p H-dependent adhesive or cohesive property for human neural ctem cell engineering[J].Advanced Functional Materials,2013, 23(14):1774-1780.

[29] HARISH PRASHANTH K V,THARANATHAN R N.Chitin/chitosan:modifications and their unlimited application potential—an overview[J].Trends in Food Science& Technology,2007,18(3):117-131.

A Green and Mix-to-use Approach for Mussel Inspired Chitasan-Catechol Hydrogel

CHEN Xi,YU Mingzhu,LIU Jian,YANG Liu*,HAN Shoufa*
(College of Chemistry and Chemical Engineering,Xiamen University,Xiamen 361005,China)

Abstract:Hydrogels have important applications in biomedical fields,such as promoting wound healing.Herein we tried to develop chitosan based adhesive hydrogels as tissue adhesives.We developed a green and mix-to-use approach for generation of mussel inspired chitasan-catechol hydrogel.An in situ gel-forming system composed of 2,4,5-three hydroxy benzaldehyde or 2,3,4-three hydroxy benzaldehyde conjugated chitosan derivatives was easily prepared,producing the hydrogels CC-1 and CC-2 respectively.In vitro study demonstrated that CC-1 could inhibit the growth of Staphylococcus aureus whereas CC-2 was a superior adhesive.In vivo wound healing study was performed by smearing hydrogels on rat dorsal wounds with a diameter of 10 mm and keeping them on for 14 days.Histological results demonstrated that CC-1 hydrogel was of high performance and comparable to commercialized wound dressing(DuoDERM)on wound healing.This approach is advantageous as no toxic byproducts are generated during making CC-1 and CC-2 hydrogels and only water is produced following formation of Schiff-base promoted hydrogels.The mix-to-use technique is of significance for commercial application.

Key words:chitosan;catechol;hydrogel;bioadhesive

*通信作者:shoufa@xmu.edu.cn(韩守法);liuyang@xmu.edu.cn(杨柳)

基金项目:国家自然科学基金(21305116);高等学校博士学科点专项科研基金(20130121120003);福建省自然科学基金(2014J01059, 2011J06004);湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室基金(2012002)

收稿日期:2015-05-13 录用日期:2015-08-19

doi:10.6043/j.issn.0438-0479.2016.02.006

中图分类号:O 631.3

文献标志码:A

文章编号:0438-0479(2016)02-0178-06

引文格式:陈曦,俞明珠,刘剑,等.绿色化学方法合成儿茶酚-壳聚糖水凝胶的应用[J].厦门大学学报(自然科学版),2016,55 (2):178-183.

Citation:CHEN X,YU M Z,LIU J,et al.A green and mix-to-use approach for mussel inspired chitasan-catechol hydrogel[J]. Journal of Xiamen University(Natural Science),2016,55(2):178-183.(in Chinese)