应用FLIVO探测顺铂引起的多器官细胞凋亡

杨琨丁大连付勇李永奇蒋海燕Richard Salvi1武汉大学人民医院耳鼻咽喉头颈外科 Center for Hearing and Deafness,University of New York at Buffalo浙江大学医学院附属儿童医院耳鼻咽喉头颈外科中山大学附属第三医院耳鼻咽喉头颈外科



应用FLIVO探测顺铂引起的多器官细胞凋亡

杨琨1，2丁大连2付勇3李永奇4蒋海燕2Richard Salvi2
1武汉大学人民医院耳鼻咽喉头颈外科
2 Center for Hearing and Deafness,University of New York at Buffalo
3浙江大学医学院附属儿童医院耳鼻咽喉头颈外科4中山大学附属第三医院耳鼻咽喉头颈外科

【摘要】顺铂是一种用于治疗恶性肿瘤的有效铂类化疗药物。然而顺铂对机体许多组织器官，如肾脏、肝脏、神经系统以及内耳等都具有毒性损害作用。FLIVO是一种能够穿越机体组织屏障进入到机体每个细胞并用荧光标记处于凋亡活动状态半胱天冬酶的亲脂性注射用示踪剂。本研究应用袢利尿剂（利尿酸钠，40mg/kg,I.V.）暂时性破坏南美栗鼠的血-迷路屏障，促使顺铂（0.8 mg/kg,I.P.）经蜗管外壁屏障消除处进入耳蜗从而引起耳蜗毛细胞凋亡。受试南美栗鼠在联合应用利尿酸钠和顺铂后6小时和18小时终止实验。为了检测顺铂引起的发生在耳蜗和中枢以及肝肾等器官的细胞凋亡，在终止实验前经颈静脉注入100μlFLIVO探测液体并使之随着血液循环60分钟以探测出现在全身各个脏器的凋亡细胞。终止实验时，对麻醉动物常规施行心脏灌流磷酸盐缓冲液5分钟，再经心脏灌流10%福尔马林磷酸盐固定液，然后分别取出耳蜗、耳蜗核、听皮层、海马以及肝肾组织并浸入上述固定液继续固定6小时。在解剖显微镜下分离取出全耳蜗基底膜并制备成全耳蜗基底膜铺片，耳蜗核、听皮层、海马、肝脏和肾脏则常规制备成冰冻切片。在共聚焦显微镜下，观察FLIVO在上述各个器官标记出的凋亡细胞。在正常南美栗鼠各个组织器官中，均未发现FLI⁃VO标记的凋亡信号；在用药后6小时，仅在耳蜗外毛细胞及肾组织中检测出凋亡细胞，但在其它器官也未发现FLIVO标记的凋亡细胞；与用药后6小时相比，在用药后18小时，所有的耳蜗外毛细胞和耳蜗底回大部分内毛细胞都呈现出荧光标记的凋亡信号，出乎意料的是，尽管耳蜗腹侧核神经元出现了大量凋亡神经元，但耳蜗背侧核的神经元却未检测到明显的凋亡信号；值得注意的是，凋亡信号还出现在更为核心的中枢海马神经元和听皮层神经元。此外，肾脏组织和肝脏组织在用药后18小时也出现大量的凋亡细胞。这些结果表明，联合应用利尿酸钠和顺铂不仅导致大量耳蜗毛细胞凋亡，而且顺铂的神经毒性作用还造成了耳蜗腹侧核大量神经元的凋亡和耳蜗背侧核和海马及听皮层的部分神经元凋亡，顺铂同样导致大量的肾脏细胞和肝脏细胞凋亡，出现在上述各个脏器的细胞凋亡现象与顺铂的耳毒性作用、神经毒性作用、肾毒性作用及肝毒性作用完全一致。

【关键词】顺铂，耳毒性，神经毒性，肾毒性，肝毒性.

Acknowledgements:This research was supported in part by National Natural Science Foundation of China Youth Foundation.No:81100712,NIH grants R01DC006630，R01DC009219,Zhejiang Provincial Natural Science Foundation No:LY14H130001,and Zhejiang Medical Research Fund Program 2014KYB077.Declaration of interest:The authors report no conflicts of interest.

1　前言

在受试动物暴露于具有毒副作用的化学试剂或重金属等实验条件下，机体多个器官或组织往往在病变早期同时发生了细胞的程序化死亡，毒物引起的细胞凋亡因此也被看作为是一种急性的病理学改变。也许是出于不同学科的重点研究对象不同，许多化学药物或重金属引起的单个器官病变已有很多报道，但观察和评估同一只实验动物体内多个器官同时发生病变的报道却不多见。以抗肿瘤药物铂制剂为例，有关顺铂及其系列化合物的肾毒性、耳毒性、神经毒性、肝毒性等毒副作用的单独实验报道比比皆是[1-5]，但对多个器官同时受损的评估却鲜有报道。因此，尽管人们对于顺铂及其系列化合物对机体多个器官的毒副作用表现和损害机制的认识逐渐加深，却很难评估这些器官之间对于顺铂类化合物的敏感性是否存在差异。

荧光标记多聚半胱天冬酶抑制剂（Fluorescent⁃ly-labeled poly-caspase inhibitor,FLIVOTM）是一种用于观察发生在活体动物各个脏器的细胞凋亡的注射用荧光探针[6-8]。当FLIVO探针通过静脉注射进入血液并循环30-45分钟之后，全身各个器官内处于凋亡过程病变细胞内的Caspase（半胱天冬酶）1、2、3、7、8、9、10、13就都会被标记上荧光信号，因此FLIVO显示的是处于凋亡活动状态的所有的半胱天冬酶。也就是说，只要细胞被标记上荧光，就说明该细胞已经进入了凋亡程序。由于FLIVO探针可穿越所有的细胞屏障并可穿越血-脑屏障和血-迷路屏障，因此FLIVO不仅适用于检测全身各个脏器中发生的细胞“自杀式”死亡，而且特别有助于证明发生在颅内的神经元凋亡和发生在内耳的毛细胞凋亡。

抗肿瘤铂类制剂可以造成多个器官的损害，但难以穿越血-脑屏障和血-迷路屏障，因此在系统应用铂类抗肿瘤药物引起的耳毒性实验动物模型，绝大多数实验动物在内耳药物浓度尚未积累到损害浓度时，便因急性肾衰或肝中毒或骨髓抑制而死亡。为了促进顺铂穿越血-迷路屏障进入内耳，在使用顺铂的同时应用袢利尿剂造成血管纹的缺血缺氧而暂时性破坏蜗管外壁的血-迷路屏障，可使顺铂和其它耳毒性药物经此“短路”进入耳蜗并迅速达到破坏耳蜗毛细胞之实验目的[5,9-16]。

本研究应用FLIVO探针技术实时观察了联合应用利尿酸钠和顺铂的南美栗鼠动物模型，对每只受试动物听觉通路的耳蜗、耳蜗核及听皮层，以及肾脏和肝脏等重要组织器官中发生的细胞凋亡进行了观察，并对上述受损器官的病变发生顺序进行了初步评估。报告如下。

2　材料与方法

2.1实验动物分组及实验设计

12只成年雄性南美栗鼠被随机分为三组，分别是正常对照组和联合应用顺铂和利尿酸钠后6小时组以及联合应用顺铂和利尿酸钠后18小时组，每组4只。联合应用顺铂和利尿酸钠的南美栗鼠按照每公斤体重0.8毫克的剂量腹腔注射顺铂并按照每公斤体重40毫克的剂量静脉注射利尿酸钠[16]。所有受试动物在处死前1小时静脉注射FLIVO以探测因顺铂毒副作用而出现在不同器官中的凋亡细胞。

2.2配制FLIVOTM工作液

本实验采用FLIVOTM in vivo Apoptosis Kit (Im⁃munoChemistry Technologies,LLC,Catalog # 983)以探测凋亡细胞。先用45ml双蒸馏水将试剂盒提供的10X injection buffer稀释成稀释注射液；再用50μlDMSO在SR-FLIVOTM小瓶内溶解131μlSR-FLIVOTM粉末将其制备成FLIVOTM储备液；临用前再用550 μl稀释注射液将FLIVOTM储备液稀释成工作液（working solution）。按照每公斤体重60毫克的剂量肌肉注射Ketamine和每公斤体重0.5毫克的剂量肌肉注射Acepromazine麻醉动物后，手术切开南美栗鼠颈部皮肤暴露颈内静脉并向颈内静脉注入100μlFLIVOTM工作液，使其在体内循环60分钟后终止实验。

2.3组织铺片或切片及复染

终止实验时，用新鲜配制的10%福尔马林PBS缓冲液施行经体循环的心脏灌流固定。心脏灌流固定方法简单介绍如下：麻醉动物在动物手术台上保持仰卧体位；沿颈部中线剪开皮肤并暴露一侧颈内静脉，用血管钳夹持颈内静脉；在胸部做一U形切口打开胸腔暴露心脏；将连接生理盐水注射泵的尖针刺入左心室并以每秒0.4毫升的速度向心脏内注入温度保持在38oC的生理盐水；同时剪开事先暴露的颈内静脉予以放血引流，使生理盐水自左心室进入主动脉经体循环从开放的颈内静脉流出；体循环灌流生理盐水3分钟左右或待颈内静脉流出的血水呈清淡时停止生理盐水灌流，再用10%福尔马林磷酸盐缓冲液继续灌流10分钟至动物肢体僵硬为止。将解剖取出的颞骨、脑组织、肾脏及肝脏浸入到前述固定液浸泡固定6小时。在解剖显微镜下分离取出耳蜗基底膜并用FITC标记的phalloidin对毛细胞的静纤毛和表皮板进行绿色荧光标记，常规铺片后在共聚焦显微镜下应用共聚焦图像处理软件从铺片和切片两种角度观察绿色荧光标记的毛细胞纤毛和表皮及FLIVO红色荧光标记的凋亡细胞。剖开脑组织分别取出耳蜗核和听皮层及海马，常规施行冰冻切片后，再用Neurofilament-200抗体施行免疫组织化学反应并用Alexa Fluor 488绿色荧光标记的二抗标记出神经元和神经纤维，封片后在共聚焦显微镜下观察绿色的神经元及其纤维和FLIVO红色荧光标记的凋亡细胞。固定后的肝脏组织和肾脏组织则常规施行冰冻切片，然后在共聚焦显微镜下观察FLIVO红色荧光标记的凋亡细胞。

3　结果

3.1顺铂引起的耳蜗毛细胞凋亡

对正常对照组动物的耳蜗铺片和切片检查发现，耳蜗内外毛细胞的表面形态结构保持正常，细胞内未发现FLIVO标记的红色荧光信号（图1A，1a）。但在联合应用顺铂和利尿酸钠后6小时组的耳蜗铺片和切片，虽然耳蜗内外毛细胞的表面结构仍然保持良好，但在许多外毛细胞的胞浆内都出现了FLIVO的红色荧光信号（图1B,1b）。在联合应用顺铂和利尿酸钠后18小时组，许多外毛细胞表面的静纤毛呈现散乱、倒伏或脱落，甚至可见个别外毛细胞的表皮已经被破坏，几乎所有存活外毛细胞的胞浆内都呈现出红色荧光标记的FLIVO（图1C,1c），同时可见部分内毛细胞也开始出现FLIVO的红色荧光标记。上述结果说明应用利尿酸钠打开血-迷路屏障后，顺铂迅速进入耳蜗内环境并首先在外毛细胞内激发了半胱天冬酶路径（Caspase pathway）的凋亡程序。

3.2顺铂引起的耳蜗腹侧核神经元凋亡

耳蜗核切片检查发现，正常对照组动物的耳蜗腹侧核和背侧核的神经元均无FLIVO标记的红色荧光信号。联合应用顺铂和利尿酸钠后6小时，耳蜗腹侧核和背侧核的绝大部分神经元都没有FLIVO阳性标记产物（图2A，2B），仅在极个别耳蜗腹侧核的神经元偶见微弱的FLIVO红色荧光信号（图2B）。注射顺铂和利尿酸钠后18小时，在耳蜗背侧核切片组织中可见散在的微小红色荧光标记物，但这些红色荧光并没有出现在神经元的细胞体内（图2C）。因此不同的是，在耳蜗腹侧核的许多神经元中却都出现了FLIVO的强烈标记（图2D），提示耳蜗腹侧核的神经元对顺铂的损害更加敏感

3.3顺铂引起的听皮层神经元凋亡

听皮层切片检查发现，正常对照组动物的听皮层神经元均无FLIVO标记的红色荧光信号。联合应用顺铂和利尿酸钠后6小时，听皮层神经元保持着良好的形态结构，在神经元及其周围组织中未见FLIVO的阳性标记产物（图3A）。但在注射顺铂和利尿酸钠后18小时，听皮层神经元的神经丝结构出现明显的病理学改变，同时可见许多神经元中出现FLIVO阳性标记产物（图3B），说明听皮层的神经元对顺铂的毒害反应相当敏感。

3.4顺铂引起的海马神经元凋亡

海马脑组织切片检查发现，正常对照组动物的海马神经元无FLIVO标记的红色荧光信号。联合应用顺铂和利尿酸钠后6小时，海马神经元区域同样未见FLIVO的阳性标记产物（图4A）。但在注射顺铂和利尿酸钠后18小时，在海马区域可见少量神经元显现FLIVO阳性标记产物（图4B），说明顺铂对海马神经元也有一定的破坏作用。

3.5顺铂引起的肝脏细胞凋亡

肝脏组织切片检查发现，正常对照组动物的肝细胞没有FLIVO标记的红色荧光信号。注射顺铂和利尿酸钠后6小时，肝细胞内同样未见FLIVO的阳性标记产物（图5A）。但在注射顺铂和利尿酸钠后18小时，肝细胞中出现大量FLIVO阳性标记产物（图5B），说明顺铂的肝毒性与其激发的肝细胞凋亡密切相关。

3.6顺铂引起的肾脏细胞凋亡

肾脏组织切片检查发现，正常对照组动物的肾皮质细胞内没有FLIVO标记的红色荧光信号（图6A）。注射顺铂和利尿酸钠后6小时，肾皮质细胞内开始出现FLIVO的阳性标记产物（图6B）。在注射顺铂和利尿酸钠后18小时，肾皮质细胞中出现大量FLIVO阳性标记产物（图6C），这一现象足以说明顺铂引起的急性肾功能衰竭与顺铂迅速激发肾皮质细胞的程序化死亡有着密不可分的关系。

4　讨论

4.1细胞凋亡的组织病理学检测方法

检查细胞凋亡的组织病理学方法有多种，包括在光镜和电镜下观察细胞形态以判断细胞是否出现核染色质聚集（nuclear chromatin aggregation）、核浓缩（nuclear condensation）、核变形、核破裂（nuclear fragmentation）、细胞发泡（blebbing）等细胞凋亡特征的病理形态学方法[2,5,9,16,17]、应用Annexin-V荧光染料标记外翻磷脂酰丝氨酸的方法[18,19]、应用亲脂性阳离子荧光染料标记线粒体跨膜电势的检测方法[9,17]、应用脱氧核苷酸和荧光素标记显示断裂DNA的3’-末端的脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL)的TUNEL标记方法[20,22]以及应用荧光标记胱天蛋白酶抑制剂显示各种活化cas⁃pase的标记方法[2,15,16,23,24]，等等。上述各种方法都仅仅适用于观察特定的组织和细胞，却无法同时检测发生在同一只动物机体内各个器官的细胞凋亡情况。我们在本实验中采用的FLIV0活体标记示踪方法，使随着血液循环流遍全身的FLIVO探测剂成功探测机体的每一个细胞并将发生在各个脏器中的凋亡细胞都标记出荧光信号，其原理是基于可穿越各种组织细胞屏障的无毒FLIVO示踪剂内所含的一个半胱天冬酶抑制肽序列与机体细胞内的活化半胱天冬酶的二聚体亚单位活化巯基结合成共价键并在该凋亡细胞内释放出荧光信号，从而达到标记凋亡细胞之目的。此方法最初被较多应用于抗肿瘤实验研究以评估抗肿瘤治疗是否能有效增加药物造成的肿瘤细胞凋亡[25]。但是如果对接种肿瘤的实验动物同时开展新的抗肿瘤药物的疗效评估和新药物对各个器官毒副作用的全身“体检”，相信FLIVO将提供有效的帮助。

4.2顺铂造成多器官内发生的细胞凋亡

顺铂的毒副作用主要包括肾毒性、神经毒性、耳毒性、骨髓抑制反应、消化道反应、以及肝毒性等。人们已经意识到肾毒性和骨髓抑制反应有可能危及生命，但对顺铂的肝毒性却知之甚少，而对顺铂的神经毒性、消化系统毒性、和听觉系统毒性反应则主要考虑是影响了患者的生活质量。本研究选择注射顺铂和利尿酸钠后6小时和18小时做为两个不同的观察时间点，在用药后6小时，在听觉系统中仅发现耳蜗外毛细胞释放出明显的凋亡信号，但绝大部分内毛细胞和听觉通路的耳蜗核神经元及听皮层神经元均未发生细胞凋亡；在用药后18小时，所有的耳蜗外毛细胞和部分内毛细胞都呈现出凋亡信号，说明顺铂引起的耳蜗毛细胞凋亡首先发生在外毛细胞，然后再逐渐启动内毛细胞的凋亡。值得注意的是，在用药后18小时，耳蜗腹侧核神经元出现了大量明显的凋亡信号，但耳蜗背侧核的神经元却未发生明显的神经元凋亡，耳蜗腹侧核和背侧核神经元对顺铂神经毒性的不同敏感性是否与耳蜗背侧核神经元内富含锌有关？[26]还有待进一步研究。除了听觉通路的神经元之外，我们还发现海马区神经元在用药后18小时也发生了细胞凋亡，但数量有限。对肝组织和肾组织的切片检查发现，在用药后6小时，肾脏组织中已经开始出现凋亡细胞，但是肝脏组织中尚未见凋亡信号，提示顺铂对肾脏的损害可能略早于对肝脏的损害；但在用药后18小时，肾脏组织和肝脏组织中都出现大量的凋亡细胞。从查阅的大量参考文献可以看出，虽然肝毒性被列为顺铂的毒副作用之一，但人们对顺铂的肝毒性仍不够重视。本实验发现顺铂确能引起大量肝细胞凋亡，提示我们在临床工作中应用铂类制剂时,应严密监测患者(尤其是已有肝功能不良的患者)的肝功能变化，并相应调整用药方案。

4.3顺铂是本实验启动细胞凋亡程序的直接原因

袢利尿剂引起暂时性听觉障碍的内耳病理学检查证实，其病变部位只是局限在血管纹上皮细胞长久以来一直误以为造成这种病理学改变的原因是因为袢利尿剂影响了血管纹细胞中钠钾ATP酶和腺苷酸环化酶的活性。直到我们首先发现并报道了造成血管纹上皮细胞酶活性改变的真正原因是因为袢利尿剂暂时性阻断了蜗管外壁的血供，才使人们意识到袢利尿剂引起的血管纹上皮病变和酶活性降低实际上都是因为血管纹缺血缺氧而发生的一系列继发性病变[2,10,13,14,15,27-29]。袢利尿剂暂时性消除血-迷路屏障的作用为促进耳毒性药物进入内耳提供了一把打开血-迷路屏障的钥匙[2,11-13,15,16,27,30]，本实验应用FLIVO再次证实联合应用袢利尿剂和顺铂在用药后数小时就启动了耳蜗毛细胞的自毁装置，这一结果与我们早先发现的顺铂首先启动initiator caspase-8进而激发cas⁃pase-3和caspase-6等executioner caspases的实验结果完全一致[5,16]。

本实验联合应用利尿酸钠和顺铂的主要目的是打开血-迷路屏障以加速实施顺铂对耳蜗毛细胞的致命攻击。虽然袢利尿剂本身也是一种耳毒性药物，但袢利尿剂对内耳的主要影响只是暂时阻断通向蜗管外壁的血流而并不影响耳蜗基底膜和螺旋神经节及前庭各终器的血液供应，血管纹上皮细胞的通透性因缺血缺氧而发生改变并因此而暂时消除了血-迷路屏障[10,11,13,14,15,28]。但是，随着袢利尿剂的药性衰减和蜗管外壁的供血恢复，血管纹上皮病变得以修复从而使内淋巴电位重新恢复。由于内淋巴电位的恢复使耳蜗感觉毛细胞表皮两侧的电位差重新出现，耳蜗各种听觉生物电反应包括耳蜗微音器电位和耳蜗总和电位以及耳蜗听神经动作电位就都重新恢复到正常水平[10,11,13,14,15,28]。由此可见，袢利尿剂对听觉的影响只是暂时性造成血管纹缺氧但并不造成耳蜗毛细胞和螺旋神经节的永久性破坏。因此，本实验发现毛细胞内出现的半胱天冬酶凋亡活动不能归因于袢利尿剂的作用而只能归因于顺铂的耳毒性反应。袢利尿剂的毒副作用主要是因为随着水和电解质的排出而造成机体电解质紊乱，但这种电解质紊乱并不直接造成机体细胞的死亡。因此，本实验发现的中枢神经元凋亡和肝脏细胞凋亡及肾脏细胞凋亡等，虽然不能完全排除电解质紊乱与顺铂毒性之间可能存在某些协同作用的关系，但这些细胞的致命性破坏原因还是应该归因于由顺铂毒性所启动的细胞凋亡程序。

图1　顺铂激发的耳蜗毛细胞内半胱天冬酶活动（黄色箭头）。正常对照动物的Corti器铺片（图1A）和沿着黄线截取的Corti器切片（图1a）显示耳蜗毛细胞的表面结构正常，细胞内未发现FLIVO标记的半胱天冬酶阳性标记物（图1A，图1a）。注射顺铂和利尿酸钠后6小时，铺片（图1B）和切片（图1b）均显示毛细胞表面结构正常，但外毛细胞的胞浆内出现FLIVO标记的半胱天冬酶红色荧光产物（图1B，图1b）。注射顺铂和利尿酸钠后18小时，铺片（图1C）显示耳蜗顶回毛细胞的表面呈现明显的静纤毛散乱或脱落（图1C），铺片（图1C）和切片（图1c）均显示外毛细胞的胞浆内显现大量FLIVO标记的半胱天冬酶红色荧光标记物（图1C，图1c）。注射顺铂和利尿酸钠后18小时，耳蜗底回不仅可见严重的毛细胞表面结构破坏（图1D），而且内外毛细胞的胞浆内均显现FLIVO标记的阳性产物（图1D，图1d）。注：红色荧光标记为活动性半胱天冬酶，绿色标记为毛细胞纤毛及其表皮版上的F-actin蛋白Figure 1.Cisplatin-induced activities of caspase enzymes in the cochlear hair cells (yellow arrow).FLIVO positive labeling was not detected either in the surface preparations (1A) or in the vertical section of organ of Corti (1a).6 hours post-cisplatin,the organ of Corti presented normal surface structures,but red fluorescent signals in active caspase enzymes only appear within the cytoplasm of the outer hair cells (1B,1b).18 hours after co-administration of cisplatin and ethacrynic acid,most hair cells at apical turn showed splayed and disarrayed stereocilia.Fluorescence labeled active caspases was detected only in outer hair cells (1C,1c).18 hours post-cisplatin/ethacrynic acid,the surface structure of cochlear hair cells in basal turn were destroyed.FLIVO marked positive caspases expressed in both inner hair cells and outer hair cells (1D,1d).Note:The red fluorescent display is the intracellular active caspase enzymes,while the green fluorescent display is the F-actin protein on the stereocilia and cuticular plate of hair cells.

图3　顺铂激发听皮层神经元内的半胱天冬酶活动（黄色箭头）。注射顺铂和利尿酸钠后6小时，听皮层神经元仍然保持良好结构，未见半胱天冬酶的FLIVO标记产物（图3A）。注射顺铂和利尿酸钠后18小时，听皮层神经元的神经丝标记明显减弱，同时可见许多神经元中显现FLIVO红色荧光标记（图3B）。注：红色荧光标记为活动性半胱天冬酶，绿色标记为Neurofil⁃ament-200标记的神经丝和神经元胞体。Figure 3.Cisplatin-induced activities of caspase enzymes in neurons in auditory cortex (yellow arrow).6 hours post-cisplatin,the neurons in auditory cortex present normal with no activation of caspases (3A).18 hours after co-administration of cisplatin and ethacrynic acid,the neurofilament staining in neurons were greatly reduced with increased positive caspases labeling (3B).Note:The red fluorescent display is the intracellular active caspase enzymes,while the green fluorescent display is the neurofilament and neuronal cell bodies.

图4　顺铂激发海马神经元内的半胱天冬酶活动（黄色箭头）。注射顺铂和利尿酸钠后6小时，在海马神经元区域未见半胱天冬酶的FLIVO标记产物（图4A）。注射顺铂和利尿酸钠后18小时，个别海马神经元中显现FLIVO红色荧光标记（图4B）。注：红色荧光标记为活动性半胱天冬酶。Figure 4.Cisplatin-induced activities of caspase enzymes in neurons in hippocampus (yellow arrow).6 hours post-cisplatin,the neurons in hippocampus present normal with no activation of caspases (4A).18 hours after cisplatin and ethacrynic acid injection,positive caspases labeling was detected in some hippocampal neurons (4B).Note:The red fluorescent display is the intracellular active caspase enzymes.

Figure 5.Cisplatin-induced activities of caspase enzymes in liver cells (yellow arrow).6 hours post-cisplatin,no positive labeling of caspases was detected in liver cells (5A).18 hours after cisplatin and ethacrynic acid injection,a large number of positive caspases occur within the liver cells (5B).Note:The red fluorescent display is the intracellular active caspase enzymes.图5顺铂激发肝细胞内的半胱天冬酶活动（黄色箭头）。注射顺铂和利尿酸钠后6小时，肝细胞内未见半胱天冬酶的FLIVO标记产物（图5A）。注射顺铂和利尿酸钠后18小时，肝细胞内出现大量FLIVO红色荧光标记（图5B）。注：红色荧光标记为活动性半胱天冬酶。

图6　顺铂激发肾皮质细胞内的半胱天冬酶活动。正常对照动物的肾脏切片未见FLIVO荧光标记（图6A）。注射顺铂和利尿酸钠后6小时，肾皮质细胞内已经开始出现FLIVO标记的半胱天冬酶（图6B）。注射顺铂和利尿酸钠后18小时，带有FLIVO标记的肾皮质细胞数量呈明显增多（图6C）。注：红色荧光标记为活动性半胱天冬酶。Figure 6.Cisplatin-induced activities of caspase enzymes in renal cortical cells (yellow arrow).FLIVO positive labeling was not detected in kidney from normal control animal (6A).6 hours post-cisplatin,positive caspases has begun to emerge within the renal cortical cells (6B).18 hours after cisplatin and ethacrynic acid injection,the number of renal cortical cells labeled with FLIVO was significantly increased (6C).Note:The red fluorescent display is the intracellular active caspase enzymes

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·基础研究·

Systemic detection of cisplatin-induced apoptosis by fluorescently-labeled poly-caspase inhibitor (FLIVO)

YANG Kun1,2,DING Dalian2,FU Yong3,LI Yongqi4,JIANG Haiyan2,Richard Salvi2
1 Department of Otolaryngology,Head and Neck Surgery,Renmin Hospital of Wuhan University,China.2 Center for Hearing and Deafness,State University of New York at Buffalo,USA 3 Department of Otolaryngology,Head and Neck Surgery,Children's Hospital,Zhejiang University,China.4 Department of Otolaryngology,Head and Neck Surgery,the Third Affiliated Hospital,Sun Yat-Sen University,China.
Corresponding author:DING DalianEmail:dding@buffalo.edu

【Abstract】Cisplatin is a platinum-based chemotherapy drug widely used to treat a variety of malignant tumors.In addition to its potent antitumor actions,cisplatin is highly toxic to multiple organs,such as the kidney,nervous system,liver,book=105,ebook=114and inner ear.FLIVO is a lipophilic injectable fluorescent tracer that crosses the blood-brain barrier,enters the cytoplasm and fluoresces in cells with activated caspases undergoing apoptosis in various organs in the body.In the current study,ethacrynic acid (EA,40 mg/kg,I.V.) was injected into chinchillas to eliminate the blood-labyrinth barrier by disrupting the epithelium on the cochlear lateral wall and enhance the influx of following intraperitoneal injection of cisplatin (Cis,0.8 mg/kg,I.P.) into the cochlea.Experimental animals were terminated 6 hours and 18 hours after Cis/EA treatment respectively.To monitor apoptosis throughout the cochlea,brain and body,100µl FLIVO detective solutions were injected through the jugular vein for 60 minutes circulation prior to termination.At the end of the experiment,animals were perfused intracardially with phosphate buffer for 5 minutes,followed by transcardially perfusion with 10% formalin in PBS.The cochlea,cochlear nucleus,auditory cortex,hippocampus,kidney,and liver were harvested and then immersed in the above mentioned fixative for 6 hours.After fixation,the cochlear basilar membrane was micro-dissected out and mounted as surface preparations.Frozen sections were made of tissues from the cochlear nucleus,auditory cortex,hippocampus,kidney and liver.Under a confocal microscope,specimens from the above mentioned organs were examined for FLIVO labeled fluorescent apoptotic cells.FLIVO labeling was absent in these organs in normal control chinchillas.At 6 hours after Cis/EA injection,evident FLIVO labeling was only detected in cochlear outer hair cells and some kidney cells,but not in other organs.In contrast,massive apoptotic cells labeled with FLIVO fluorescence appeared among cochlear hair cells at 18 hours post-Cis/EA.Surprisingly,extensive apoptotic labeling was also seen in the ventral cochlear nucleus,but not in the dorsal cochlear nucleus 18 h after Cis/EA treatment.Remarkably,moderate apoptotic labeling appeared at more central loci such as the hippocampus and auditory cortex.In addition,massive apoptotic labeling also appeared in kidney and liver cells 18 hours post-Cis/EA injection.These results indicate that Cis/EA treatment not only results in massive apoptosis in the cochlea,but widespread neurotoxicity with heavy cell death in the ventral cochlear nucleus and moderate apoptosis in the hippocampus and auditory cortex,as well as in the kidney and liver,which are consistent to the ototoxicity,neurotoxicity,nephrotoxicity,and hepatotoxicity properties of cisplatin.

【Keywords】cisplatin,ototoxicity,neurotoxicity,nephrotoxicity,hepatotoxicity.

收稿日期：（2015-10-29审核人：郭维维）

通讯作者：丁大连，Email:dding@buffalo.edu

作者简介：杨琨，博士，主治医师，研究方向:耳科学及听力学

基金项目：国家自然科学基金青年基金.No 81100712；NIH grants R01DC006630，R01DC009219；浙江省自然科学基金.No:LY14H130001；浙江省医药卫生科学研究基金计划.2014KYB077.

DOI:10.3969/j.issn.1672-2922.2016.01.023

【中图分类号】R916.696

【文献标识码】A

【文章编号】1672-2922（2016）01-104-7