HE4在卵巢上皮性肿瘤组织中的表达

任俊英 李银凤 王维琴 皇甫昱

[摘要] 目的 通过检测HE4在卵巢上皮性恶性肿瘤、卵巢良性肿瘤、异位子宫内膜、正常内膜中的表达，把HE4作为一个肿瘤标记物，来鉴别盆腔肿物性质提供诊断依据。 方法 整群选取内蒙古人民医院2012年7月—2014年7月收治的167例手术患者，通过病理确诊：其中子宫内膜异位症的60例，卵巢良性肿瘤组织标本30例，正常内膜组织的因子宫病变而进行子宫全切术的患者30例，上皮性卵巢癌47例。采用免疫组化实验方法对各组石蜡切片进行化学染色，并进行对各组标本染色结果的染色强度进行评价，同时应用mIgae-or-plus对染色切片中的阳性部分测量其平均灰度值（meanIOD），并分析HE4在各组中的表达情况。结果 子宫内膜异位症、卵巢上皮性恶性肿瘤、正常内膜中均有HE4的表达，HE4在卵巢良性肿瘤中的表达呈弱阳性或者阴性表达。HE4的表达在卵巢上皮性恶性肿瘤、子宫异位内膜、正常内膜、卵巢良性肿瘤中表达呈逐级下降趋势，HE4在四种不同组织中的表达的mean IOD值差异有统计学意义（P<0.05），而且进行两两组间比较均差异有统计学意义（P<0.05）。结论 ①HE4在卵巢上皮性恶性肿瘤、子宫内膜异位症、正常内膜、卵巢良性肿瘤中的表达呈现逐级下降趋势，通过探索性研究，HE4可能作为一个良好的卵巢肿瘤标记物，有助于来鉴别盆腔肿物性质提供诊断依据；也表明HE4对肿瘤的发生、侵袭、转移、预后等发挥着重要作用。

[关键词] HE4；卵巢肿瘤；子宫内膜异位症；免疫组化

[中图分类号] R737.31 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2016）03（b）-0015-04

[Abstract] Objective To detect the expression of HE4， a tumor marker， in patients with malignant epithelial ovarian cancer， benign ovarian tumor， endometriosis and normal endometrium so as to provide a diagnostic base for the identification of pelvic tumor. Methods In this study， 167 tissue specimens are from the Department of Pathology， Inner Mongolia Peoples Hospital， from July 2012 to July 2014. Totally 60 endometriosis samples were investigated as the experimental group， the benign ovarian tumor tissue samples from 30 cases and normal endometrium tissue samples from 30 cases underwent hysterectomy due to uterine lesions were set as the negative control respectively， and 47 samples of epithelial ovarian cancer as the positive control group. The expression of HE4 was examined by immunohistochemical staining between experimental group and control group. The expression intensity of HE4 was estimated by the microscope. The mean IOD of positive expression rates of HE4 were determined by mIgae-or-plus. The expression of HE4 in the groups was analyzed. Results Endometriosis， malignant epithelial ovarian tumor and normal endometrium had the distinct expression of HE4. The expression of HE4 was weakly positive or negative in benign ovarian tumor. The expression of HE4 showed a step-down trend in the malignant epithelial ovarian tumor， endometriosis， normal endometrium and benign ovarian tumor， and the mean IOD value of HE4 expression in the four different tissues had significant difference （P<0.05）， and pairwise comparisons were statistically significant（P<0.05）. Conclusion The expression of HE4 showed a step-down trend in the malignant epithelial ovarian tumor， endometriosis， normal endometrium and benign ovarian tumor. The study indicated that HE4 may be a good epithelial ovarian tumor marker， which provides diagnostic basis for identifying the nature of pelvic tumor； and plays an important role in the oncogenesis， invasion， metastasis， and outcome of the tumor.

[Key words卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率逐年上升，病死率居女性生殖系统恶性肿瘤之首，5年生存率有早期的80%下降为晚期的15%[1]。目前，对于早期诊断卵巢癌其敏感性和准确性均欠佳。因此对2012年7月—2014年7月就诊于内蒙古自治区人民医院患者，根据术后病理确诊为卵巢上皮性恶性肿瘤、卵巢良性肿瘤、异位子宫内膜、正常内膜进行免疫组化检测HE4的表达结果，有望把HE4作为一个肿瘤标记物[2]，来鉴别盆腔肿物性质提供诊断依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

整群选择内蒙古自治区人民医院2012年7月—2014年7月收治的手术病例167例，通过病理确诊的卵巢肿瘤手术患者石蜡标本，其中上皮性卵巢癌47例年龄35～82岁，平均年龄45.5岁，卵巢良性肿瘤组织标本30例年龄16～67岁，平均年龄34.4岁，子宫内膜异位症的60例年龄31～52岁，平均年龄35岁，正常内膜组织的因子宫病变而进行子宫全切术的患者30例年龄41～56岁，平均年龄49岁。实验组：异位内膜组织蜡块60例。阴性对照组：卵巢良性肿瘤组织标本30例正常对照组：正常内膜组织标本30例；阳性对照组：卵巢上皮性恶性肿瘤组织标本47例。4组样本之间差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 试剂及方法

一抗：即用型兔抗人HE4多克隆抗体购于武汉博士德生物工程有限公司，规格100 ug浓缩液。批号14406-1AP；保存开封后4℃保存。二抗：即用型SABC免疫组化染色试剂盒，规格：12 mL 4℃保存，避免冷冻，DAB试剂盒：以上试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 试验方法

免疫组化染色：标本石蜡块，制作成4 μm石蜡切片，烤片，脱蜡，水化，滴加3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，用0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）热修复抗原，5%BSA封闭液滴加于每张切片，每张切片滴加第一抗体兔抗人多克隆抗体HE4，4℃冰箱过夜，PBS液洗片，每张切片加试剂山羊抗兔IgG，20～37℃温箱下卵育20 min，PBS冲洗，每张切片滴加SABC，室温下孵育15 min，DAB显色，苏木精复染，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，封片，然后在显微镜下阅片并照相。

观察标准：病理科由2名医生用双盲法分别进行阅片监测。综合染色强度和阳性细胞百分率分布按照SHIMIZU等方法确定HE4在组织中的表达水平。①染色强度，染色不清楚（和）或无染色为0分；染色强于阴性显示为弱黄色为1分；染色清晰棕黄色为2分；染色强为深棕色（和）或褐色为3分。②阳性细胞百分率：阳性细胞数<10%为0分；11%～25%为1分；26%～50%为2分；>50%为3分。每张切片计分等于以上二项分数的乘积；0～1分为（-）；2～3分为弱阳性（+）；4～5分为中度阳性（++）；﹥5分为强阳性（+++）。

mIgae-or-plus5.0专业图像分析系统下，测量每张切片的阳性细胞的平均灰度值（mean IOD）并将数据进行统计学分析。

1.4 统计方法

所得数据均应用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理分析。计量资料以（x±s）表示，两独立样本均数比较用t检验；多个样本均数比较，经检验方差不齐，采用多个独立样本比较的秩和检验；计数资料组间两两比较采用行×列资料分割的χ2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HE4在子宫异位内膜、卵巢上皮性恶性肿瘤、卵巢良性肿瘤、正常内膜组织中的表达情况

根据测得的平均灰度值分析HE4在四个组间的表达情况：卵巢上皮性恶性肿瘤组织中HE4颗粒定位于组织中的细胞浆里，呈棕褐色腔缘阳性颗粒，其表达的mean IOD值为（0.4982±0.0284）。异位内膜组织中HE4颗粒定位于子宫内膜腺上皮细胞胞膜及细胞浆中呈棕黄色阳性颗粒部分间质可见阳性表达，其表达的mean IOD值为（0.5801±0.0115）。正常内膜组织中HE4颗粒定位于子宫内膜腺上皮细胞胞膜及细胞浆中呈淡黄色弱阳性颗粒，部分间质可见弱阳性表达，其表达的mean IOD值为（0.6801±0.0105）。卵巢良性肿瘤组织中HE4颗粒定位于组织中的细胞浆里，呈淡黄色弱阳性颗粒或阴性表达，其表达的meanIOD值为（0.7582±0.0172）。

将上述4组HE4表达的meanIOD值比较，（F检验）差异有统计学意义（F=10.162，P<0.05）（见表1）。4组资料两两比较，各组间比较，差异有统计学意义（P<0.05）。

注：子宫内膜异位症与卵巢上皮性癌两组间比较，t=77.894，P=0.000；子宫内膜异位症与正常内膜两组间比较，t=59.346，P=0.000；子宫内膜异位症与卵巢良性肿瘤两组间比较，t=59.345，P=0.000。

2.2 HE4在4组不同组织中阳性表达的频数分布进行比较

HE4在卵巢上皮性恶性肿瘤中表达主要为强阳性过表达，而卵巢异位内膜组织中为阳性表达，正常内膜组织中为弱阳性表达，卵巢良性肿瘤组织多数为阴性表达。经行×列资料分割的χ2检验对4种组织中HE4的频数分布比较：卵巢上皮性恶性肿瘤组织中HE4的频数分布与其他3组的频数分布均差异有统计学意义（P=0.000）：卵巢异位内膜组织HE4的频数分布与正常内膜组织、卵巢良性肿瘤组织的频数分布差异有统计学意义（P=0.000）；正常内膜组织与卵巢良性肿瘤组织的频数分布差异无统计学意义（χ2=0.800，P=0.371﹥0.05）。见表2。

注：四组资料两两比较，除正常内膜组与卵巢良性肿瘤组相比，χ2=0.800，P=0.371>0.05，无统计学意义，其余各组间比较P<0.05，差异有统计学意义。

3 讨论

HE4 属于抑蛋白酶基因家族，定位于染色体20q12 -13. 1，编码一种与精子成熟相关的小分子分泌蛋白[3] 。HE4cDNA 最早是由Kirchhoff 等于1991 年从人的附睾上皮细胞中发现的，进一步的研究发现其主要分布于包括附睾在内的生殖系统上皮，如输精管上皮、输卵管上皮和子宫内膜等组织[4]。研究显示，HE4 在多种恶性肿瘤，如浆液性卵巢癌、肺腺癌、乳腺癌、胃癌等组织中高表达。大量研究表明，HE4 在识别卵巢癌的早期阶段具有很高的灵敏度和特异度。该实验研究结果显示：HE4在卵巢浆液性囊腺癌中的表达与子宫内膜异位症、正常内膜、卵巢良性肿瘤中的表达差异有统计学意义（P=0.000），其中HE4在卵巢浆液性囊腺癌中逞强阳性表达，在子宫内膜异位症的表达呈中度阳性表达而正常内膜、卵巢良性肿瘤中的表达呈弱阳性或阴性表达。大量研究表明，HE4 在识别卵巢癌的早期阶段具有很高的灵敏度和特异度，因此国外许多国家已将HE4 作为卵巢癌早期筛查的最佳指标。 陈颖等[5]发现HE4 mRNA 表达在卵巢癌发生中作为早期分子事件发挥重要作用，通过研究卵巢交界性肿瘤、早期卵巢癌和卵巢癌组中HE4mRNA阳性表达率分别为81.0%、85.4%和88.2%， 发现HE4 mRNA 表达上调参与了卵巢癌发生和侵袭。HE4作为一个良好的卵巢肿瘤性标记物，有助于鉴别盆腔肿物性质提供依据，并且可检测卵巢恶性肿瘤的预后及术后复发[6-8]这也表明HE4对肿瘤的发生、侵袭、转移、预后等发挥着重要作用。

综上所述通过对HE4不同检测值范围的比较，有望制定一个监测标准范围，以便可以诊断卵巢上皮癌与子宫内膜异位症，进一步对卵巢上皮性癌、子宫内膜异位症、盆腔良性包块的鉴别作为一个重要依据[9]。HE4对于卵巢上皮性恶性肿瘤、子宫内膜异位症均有很好的辅助诊断价值。但对于疾病的早期诊断，如果还能同时结合超声及妇科检查可进一步提高其诊断的特异性和准确性。HE4在子宫内膜异位症与卵巢浆液性囊腺癌的发病可能有相似的病理学基础，且HE4很可能在该类疾病中的某个环节发挥一定的作用。有待于进一步研究，制定一个医学参考值范围，把HE4作为一个很好的卵巢肿瘤标记物对盆腔肿物的性质做出鉴别诊断[10]。

[参考文献]

[1] 谢幸，苟文丽.妇产科学[M].8版.北京：人民卫生出版社，2013.

[2] Rafael Molina， Jose M. Escudero， Jose M. Augé， et al. HE4 a novel tumour marker for ovarian cancer： comparison with CA 125 and ROMA algorithm in patients with gynaecological diseases[J]. Tumour Biol，2011， 32（6）： 1087-1095.

[3] Galgano MT， Hampton GM， Frierson HF Jr. Comprehensive analysis of HE4 expression in normal and malignant human tissues [J]. Modern Pathology， 2006， 19（6）： 847-853.

[4] Drapkin R， Lin Y， Mok SC， et al .Human epididymis protein 4（HE4） is a secreted glycoprotein that is over ex-pressed by serous and endometrioid ovarian carcinomas[J].Cancer Res， 2005，65（6）：2162-2169.

[5] 陈颖，张岩，蒋宏颉.HE4 mRNA 在卵巢癌中的表达及临床意义的研究[J].中国误诊学杂志，2010，10（23）：5548-5551.

[6] Partheen K， Kristjansdottir B， Sundfeldt K. Evaluation of ovarian cancer biomarkers HE4 and CA-125 in women presenting with a suspicious cystic ovarian mass[J]. J Gynecol Oncol，2011，22（4）：244-252.

[7] Bolstad N， ijordsbakken M， Nustad K， et al. Human epididymis protein 4 reference limits and natural variation in a Nordic reference population[J].Tumour Biol，2012，33（1）：141-148.

[8] Chen WT，Gao X，Han XD，et al.HE4 as a serum biomarker for ROMA prediction and prognosis of epithelial ovarian cancer[J].Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（1）：101-105.

[9] Gislefoss RE ， Langseth H ， Bolstad N ， et al.HE4 as an Early Detection Biomarker of Epithelial Ovarian Cancer： Investigations in Prediagnostic Specimens From the Janus Serumbank[J].Int J Gynecol Cancer，2015，25（9）：1608-1615.

[10] Wilailak S，Chan KK，Chen CA，et al.Distinguishing benign from malignant pelvic mass utilizing an algorithm with HE4， menopausal status， and ultrasound findings[J].J Gynecol Oncol，2015，26（1）：46-53.

（收稿日期：2015-12-15）] HE4； Ovarian tumor； Endometriosis； Immunohistochemistry