不同类型树脂分离纯化东风桔总生物碱的筛选

董臣林，黄永昌，尹永芹，冯淡开，沈志滨

(1.广东药学院中药学院，广东 广州　510006；2.广东恒建制药有限公司，广东 江门　529000)



◇药学研究◇

不同类型树脂分离纯化东风桔总生物碱的筛选

董臣林1，黄永昌1，尹永芹1，冯淡开2，沈志滨1

(1.广东药学院中药学院，广东 广州510006；2.广东恒建制药有限公司，广东 江门529000)

摘要：目的筛选适合用于分离纯化东风桔总生物碱的树脂。方法 采用酸性染料比色法测定总生物碱的含量，以静态吸附率及解吸率为指标，对15种不同类型的树脂进行筛选，然后通过单因素法考察上样液pH值、吸附温度、吸附时间等对树脂吸附效果进行优化。结果001*7阳离子交换树脂对东风桔总生物碱效果较好，总生物碱的吸附率达到73.51%，解吸率达到90.58%，在单因素试验中，上样液pH=2～3，T=50℃，吸附6 h时，具有最优的吸附效果。结论 001*7阳离子交换树脂适合用于东风桔总生物碱的分离纯化，为其进一步的富集工艺研究及新药研发提供实验参考。

关键词:东风桔；总生物碱；树脂

东风桔[Atalantiabuxifolia(Poir.) Oliv.ex Benth]为芸香科植物酒饼簕的根及根茎部分，性温，味微辛、苦，归肺、胃、脾经，产于广东、广西、海南等地，被收录于《广东省中药材标准》。东风桔作为一种常用的民间用药，具有祛风散寒、行气止痛功效，临床上主要用于治疗支气管炎、风寒咳嗽、感冒发烧、风湿性关节炎、慢性胃炎、胃溃疡及跌打肿痛等[1-3]，效果显著。东风桔主要含有挥发油、柠檬苦素、生物碱、香豆素、黄酮等类成分[4]，有文献报道[5]，其生物碱具有较好的化痰、止咳、平喘的活性。目前，对于总生物碱分离纯化方法主要涉及有酸提碱沉法、有机溶剂萃取法、大孔树脂法、阳离子交换树脂法，其中后两者具有富集率高，安全性好，可以重复使用等优点而得到广泛的应用[6-8]。本文以吸附率、解吸率为指标，对不同类型的树脂进行筛选，得到适用于分离纯化东风桔总生物碱的最佳树脂，为进一步富集工艺研究及新药研发提供参考[9-13]。

1仪器及材料

1.1仪器UV-2450紫外—可见光光度计(日本岛津)，电子恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)，BP211D型十万分之一电子分析天平(德国赛多利斯公司)，DS8510DT超声清洗器(上海生析超声仪器有限公司)。1.2材料东风桔药材采自广东电白市，由广东药学院刘基柱教授鉴定为芸香科酒饼簕属东风桔[Atalantiabuxifolia(Poir.) Oliv.ex Benth]的根及根茎，标本存放于广东药学院中药化学实验室。对照品生物碱(Buxifoliadine-B,自制，纯度>98%)，溴甲酚绿(天津市天新化工开发中心)、枸橼酸(天津福晨化学试剂厂)、三氯甲烷(天津市致远化学试剂有限公司)、磷酸氢二钠(天津市致远试剂有限公司)等均为分析纯，乙醇为工业级(可食)，水为超纯水，HPD100、HPD400、HPD450、HPD600、HPD826、HPD722均购于河北宝恩生物科技有限公司，801、818、001*1、001*4、001*7购于安徽三星树脂科技有限公司，D4020、AB-8、NKA-9购于南开大学化工厂。

2方法与结果

2.1样品溶液的制备[14]

2.1.1对照品溶液的制备精密称定Buxifoliadine-B 21.25 mg至50 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，即得。

2.1.2供试品溶液的制备 取东风桔药材粉末(80目)1 g，加入乙醇50 mL，精密称定，浸润30 min，超声提取1 h，加乙醇补足质量，过滤，取过滤液25 mL蒸干，残渣用乙醇溶解并转移至10 mL量瓶中，加乙醇稀释至刻度，即得。

2.2总生物碱的含量测定

2.2.1检测波长考察 精密吸取对照品溶液1 mL和供试品溶液2 mL，分别置于25 mL量瓶中，水浴挥去溶剂，各加入pH=3.4枸橼酸—磷酸氢二钠缓冲液5 mL，溴甲酚绿溶液2 mL和三氯甲烷10 mL，密塞，剧烈振摇3 min，转移至分液漏斗中，静置30 min，分取三氯甲烷层，滤过，取滤液测定。同法制得空白溶液作为参比，于200～800 nm进行全波长扫描，结果显示二者均在410 nm处有最大吸收，故确定检测波长410 nm。

2.2.2标准曲线的制备 精密吸取对照品溶液0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.5 mL，分别置于5.0 mL容量瓶中，加乙醇定容至刻度，摇匀，精密吸取2.5 mL，按“2.2.1”项下方法显色以质量浓度(X)为横坐标，峰面积A为纵坐标(Y)，得回归方程Y=3.427X+0.003 8(r=0.999 8)，线性范围0.008 5～0.382 5 g·L-1。

2.2.3精密度试验 精密吸取对照品溶液1 mL，按“2.2.1”项下方法显色，平行测定6次，计算峰面积A的RSD为0.26%，仪器精密度符合要求。

2.2.4 重复性试验 取6份东风桔药材粉末各约1 g，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2.1”项下方法显色，结果Buxifoliadine-B平均提取量3.11 mg·g-1，RSD为1.32%，该方法重复性良好。

2.2.5稳定性试验 取供试品溶液和对照品溶液，依法显色后，分别于制备后30、60、90、120 min测定锋面积A，结果RSD为1.90%，待测溶液在2 h内稳定。

2.2.6加样回收率试验 精密称取6份东风桔药材粉末，每份0.5 g，分别加入Buxifoliadine-B对照品适量，依次按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2.1”项下方法显色，结果平均回收率为99.33%，RSD为1.67%。

2.3树脂型号筛选

2.3.1吸附能力考察 提取液减压回收至无乙醇味，用蒸馏水定容至浓度为生药量0.15 g·mL-1的浓缩液，分别取803、801、818、D4020、HPD100、NKA-9、AB-8、HPD600、HPD826、HPD450、HPD722、HPD400、001*1、001*4、001*7这15种处理好的树脂，各取20 mL于具塞三角瓶中，加入2倍量体积的浓缩液静态吸附12 h，不时搅拌。取上清液测总生物碱的含量，计算树脂的吸附率，结果见表1。

表1　不同型号树脂的吸附能力考察

注：吸附率=(吸附前溶液总生物碱量-吸附后溶液总生物碱量)/吸附前溶液总生物碱量×100%。

2.3.2解吸附能力的考察 对有较好吸附效果的803、NKA-9、AB-8、001*1、001*4、001*7这6个型树脂进行解吸附能力考察，将吸附饱和的树脂装到玻璃柱，用蒸馏水洗涤除去杂质，至流出的水澄清，pH=6时，再用95%乙醇洗脱树脂至洗脱剂澄清，以洗脱的最大体积为标准，其它型号树脂继续用95%乙醇洗脱，使得最终洗脱体积相等，记录洗脱液的体积，测量并计算总生物碱的含量。取一定体积的洗脱液放于已经恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸至近干，再放置105℃烘箱中干燥至恒重，然后称定重量，计算膏重，结果见表2，根据树脂型号吸附率和解吸率最终筛选出001*7为理想的树脂。

表2　不同型号树脂的解吸能力的考察

注：总生物碱含量=测膏重的溶液体积/测含量的体积×测含量的体积的总生物碱/膏重×100%。

2.4静态吸附总生物碱的影响因素考察

2.4.1上样液pH值考察提取液减压回收至无乙醇味，用蒸馏水定容至浓度为生药量0.15 g·mL-1的浓缩液，取5份处理好的树脂20 mL倒入具塞三角瓶中，吸走水分，倒入40 mL浓缩液，用盐酸和氨水调pH到2、4、6、8、12，加盖，放置于35℃水浴中吸附12 h，每隔1 h搅拌。将吸附好的树脂转移到玻璃柱中，用蒸馏水冲至流出的水澄清，pH为中性后，用95%乙醇洗脱，洗脱至流出液无颜色，以洗脱的最大体积为标准，其它型号树脂继续用95%乙醇洗脱，使得最终洗脱体积相等，记录洗脱体积，取0.5 mL洗脱液测含量。结果见表3，001*7对东风桔总生物碱的吸附率随pH的下降而上升，所以选择pH=2为上样液pH值。

表3　上样液pH值对吸附效果的影响

2.4.2吸附温度考察提取液减压回收至无乙醇味，用蒸馏水定容至浓度为生药量0.15 g·mL-1的浓缩液，取3份处理好的树脂20 mL倒入具塞三角瓶中，吸走水分，倒入40 mL浓缩液，用盐酸调pH=2，加盖，分别放置于25、35、50℃水浴中吸附12 h，每隔1 h搅拌。将吸附好的树脂转移到玻璃柱中，用蒸馏水冲至流出的水澄清，pH为中性后，用95%乙醇洗脱，洗脱至流出液无颜色，以洗脱的最大体积为标准，其它型号树脂继续用95%乙醇洗脱，使得最终洗脱体积相等，记录洗脱体积，取0.5 mL洗脱液测含量。结果见表4，结果表明001*7对东风桔总生物碱的吸附率随温度的升高而升高，但根据001*7树脂的使用范围，选定50℃为最佳吸附温度。

表4　温度对树脂吸附效果的影响

2.4.3吸附时间考察 提取液减压回收至无乙醇味，用蒸馏水定容至浓度为生药量0.15 g·mL-1的浓缩液，取5份处理好的树脂20 mL倒入具塞三角瓶中，吸走剩下的少量水分，倒入40 mL浓缩液，用盐酸调pH=2，加盖，放置于50℃水浴中分别吸附1、2、3、6、12 h，每隔1 h搅拌。将吸附好的树脂转移到玻璃柱中，用蒸馏水冲至流出的水澄清，pH为中性后，用95%乙醇洗脱，洗脱至流出液无颜色，以洗脱的最大体积为标准，其它型号树脂继续用95%乙醇洗脱，使得最终洗脱体积相等，记录洗脱体积，取0.5 mL洗脱液测含量。结果见表5，结果表明6 h后树脂吸附饱和。

表5　时间对树脂吸附效果的影响

2.5验证试验 精密量取25 mL处理好的001*7离子交换树脂3份放置于具塞三角瓶中，加入pH=2的浓缩液，放于50℃水浴中吸附6 h并不时搅拌，将吸附好的离子交换树脂转移到玻璃柱，用蒸馏水以2BV/H流速冲至流出液澄清，pH=6。用95%乙醇洗脱，洗脱至流出液无颜色，以洗脱的最大体积为标准，其它型号树脂继续用95%乙醇洗脱，使得最终洗脱体积相等，记录洗脱体积，取0.5mL洗脱液测含量。取一定体积的洗脱液放于已经恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸至近干，再放置105℃烘箱中干燥至恒重，然后称定重量，计算膏重。结果见表6，总生物碱平均富集率为66.11%。

表6　001*7离子交换树脂应用于东风桔

3讨论

企业常用酸溶碱沉法富集总生物碱，但此方法只能针对叔胺型生物碱，应用范围有限，虽然大孔树脂已经在中药领域内大量应用，但还没特定针对生物碱的型号，难以使富集率达到50%以上[15-16]。阳离子交换树脂原理是离子交换，能针对性吸附溶液中的生物碱阳离子，专属性强。东风桔中生物碱种类主要为吖啶酮类生物碱，分别为仲胺和叔胺类，碱性较弱，用所以选强酸型阳离子交换树脂效果较好，使得生物碱的富集率达到50%，符合中药5类新药注册要求。

在考察离子交换树脂相关参数时，考虑到离子交换的速度比较慢，根据因素影响的大小和考虑到工业生产，选择了上样液pH值、吸附温度、吸附时间为考察因素。上样液pH是影响吸附的最大因素，在pH=2～3时，生物碱以离子态存在才能交换到阳离子交换树脂的-SO3-上被吸附。交联度大的离子交换树脂交换量高，但网孔小，不利于生物碱分子扩散入树脂内进行交换，交联度小的树脂网孔大，有利于生物碱分子扩散进入树脂内进行交换，但交换量少。东风桔生物碱分子量大小范围为300～550，结果表明001*7阳离子交换树脂相对于001*4、001*1树脂从交联度和交换容量都更加适合。

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Comparison of different resins for isolation and purification of total alkaloids from Atalantia buxifolia

DONG Chen-lin, HUANG Yong-chang, YIN Yong-qin, et al

(SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou,Guangdong510006,China)

Abstract:ObjectiveTo select proper resins for isolation and purification of total alkaloids from Atalantia buxifolia. MethodsThe content of total alkaloids was determined by acid dye-colorimetry. With the adsorption rate and desorption rate of total alkaloids as the observation indexes, the optimized resin was selected by screening 15 types of resins. And then the resin adsorption influence factors were investigated by single-factor experiments based on pH, temperature and adsorption time. Results The 001*7 cation-exchanging resin had good adsorption and desorption activities, with an adsorption rate being 73.51% and a desorption rate being 90.58%. The optimum adsorption process: the extracting solution pH=2～3, T=50 ℃, and adsorbing time 6 hours. ConclusionThe 001*7 cation-exchanging resin could be used for total alkaloids enrichment, which could also provide a reference for further study.

Key words：Atalantia buxifolia;total alkaloids;resin

(收稿日期：2015-11-20，修回日期：2016-01-20)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.04.006

作者简介：董臣林，男，硕士研究生通信作者：沈志滨，女，教授，硕士生导师，研究方向：中药活性成分研究及新药研发，E-mail：szb8113@126.com

基金项目:广东省自然科学基金(No 2015A030313585)；中医药行业专项基金(No 201507004)