高效液相色谱法测定克痤隐酮凝胶中丹参酮粉含量

蔡丽娟，臧恒昌

(1.山东大学药学院，山东 济南　250012；2.合肥立方制药股份有限公司，安徽 合肥　230088)



高效液相色谱法测定克痤隐酮凝胶中丹参酮粉含量

蔡丽娟1,2，臧恒昌1

(1.山东大学药学院，山东 济南250012；2.合肥立方制药股份有限公司，安徽 合肥230088)

摘要：目的建立高效液相色谱法同时测定丹参酮ⅡA与隐丹参酮的检验方法，以评价克痤隐酮凝胶中丹参酮粉的含量。方法采用C(18)(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流动相：甲醇—水(85∶15)；流速：1.0 mL·min(-1)；检测波长：254 nm。结果丹参酮ⅡA在5.04～100.80 mg·L(-1)的浓度范围内，峰面积A与浓度C呈良好的线性关系r=1.00，回收率为98.37%，RSD=0.45%(n=6)；隐丹参酮在浓度5.04～100.87 mg·L(-1)的范围内，峰面积 A与浓度C呈良好的线性关系r=1.00，回收率为98.43%，RSD=0.41%(n=6)。结论该方法简便、准确、重现性好，可用于克痤隐酮凝胶中丹参酮粉含量测定。

关键词：高效液相色谱法；克痤隐酮凝胶；丹参酮ⅡA；隐丹参酮

克痤隐酮凝胶是以中药为主的中西药复方制剂，其组方为丹参酮粉、维生素E、维生素A、甲氧苄啶，临床上主要用于抑制皮脂腺分泌及痤疮杆菌生长。其中主要成分丹参酮具有温和的雌激素的活性，同时对革兰阳性菌和痤疮棒状杆菌有较明显的抑制作用，还有显著的抗炎作用，对痤疮的验证反应切实有效[1-4]。本文通过查阅相关文献[5]，建立高效液相色谱法同时测定丹参酮ⅡA与隐丹参酮的检验方法，来评价克痤隐酮凝胶中丹参酮粉的含量。

1仪器和试剂

1.1仪器 岛津LC-20AT高效液相色谱仪、岛津SPD-20A检测器,GL sciences(250 mm×4.6 mm，5 μm)C18色谱柱，LC solution工作站，梅特勒-托利多XS205电子天平。

1.2试剂甲醇为色谱纯(Sigma)、水为高纯水(合肥立方制药股份有限公司自制)、乙醚为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)；丹参酮ⅡA对照品、隐丹参酮对照品(中国药品生物制品检定所)；克痤隐酮凝胶(合肥立方制药股份有限公司，批号：20140101、20140501、20140601、20140602)。

2方法与结果

2.1检测方法

2.1.1色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇—水(85∶15)为流动相；检测波长为254 nm；理论板数按丹参酮ⅡA 峰计算应不低于2 000，按隐丹参酮峰计算应不低于2 000。

2.1.2对照品溶液的制备取丹参酮ⅡA对照品 0.5 mg，隐丹参酮对照品 0.5 mg，精密称定，置10 mL棕色量瓶中，用甲醇超声使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.3供试品溶液的制备取本品 5 g，精密称定，加层析用硅胶(100～200目)10 g，拌匀，用乙醚湿法装入色谱柱(内径2.5 cm)上，用乙醚洗脱至色谱柱无色为止，收集乙醚洗脱液，挥干，残渣加甲醇使溶解，定量转移至10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.4测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.2专属性实验

2.2.1溶液的制备(1) 丹参酮ⅡA对照品溶液：取丹参酮ⅡA对照品适量，精密称定，加甲醇使溶解并定量稀释制成 50 mg·L-1的溶液，摇匀；(2)隐丹参酮对照品溶液：取隐丹参酮对照品适量，精密称定，加甲醇使溶解并定量稀释制成50 mg·L-1的溶液，摇匀，再精密量取5.0 mL，置10 mL棕色量瓶中，摇匀，即得；(3)混合对照溶液：取丹参酮ⅡA对照品、隐丹参酮对照品适量，精密称定，加甲醇使溶解并定量稀释制成50 mg·L-1的溶液，摇匀，即得；(4)供试品溶液：取本品5 g，精密称定，加层析用硅胶(100～200目)10 g，拌匀，用乙醚湿法装入色谱柱(内径2.5 cm)中，用乙醚洗脱至色谱柱无色为止，收集乙醚洗脱液，挥干，残渣加甲醇使溶解，定量转移至10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；(5)空白辅料溶液：取处方配比量的空白辅料(去除丹参酮粉)5 g，照供试品溶液制备方法处理，即得。

2.2.2检验结果如图1～5所示，空白试验溶剂和空白辅料在主峰处无明显吸收，即空白试验溶剂和空白辅料不干扰含量检测。隐丹参酮保留时间约为8 min，丹参酮ⅡA保留时间约为12 min。样品中丹参酮ⅡA 峰理论塔板数为7 813，隐丹参酮峰理论塔板数为6 305，符合要求。

图1　丹参酮ⅡA对照品溶液

图2　隐丹参酮对照品溶液

图3　混合对照品溶液

图4　供试品溶液

图5　空白辅料溶液

2.3线性与范围精密称取隐丹参酮对照品 10.22 mg，丹参酮ⅡA对照品10.08 mg，置同一个100 mL棕色量瓶中，用甲醇超声溶解，并稀释至刻度，作为储备液。精密量取储备液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、10.0 mL分别至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。精密量取10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，分别取峰面积对浓度做线性方程，丹参酮ⅡA：线性方程为：A=48 025.45C-1 015.93, 相关系数r=1.00;隐丹参酮：线性方程为：A=41 263.59C+6 631.63, 相关系数r=1.00;丹参酮ⅡA在5.04～100.80 mg·L-1的浓度范围内，隐丹参酮在浓度5.04～100.87 mg·L-1的范围内，峰面积A与浓度C呈良好的线性关系。

2.4仪器精密度试验精密量取“2.3”项下储备液5.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液10 μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，丹参酮ⅡA的峰面积的RSD为0.13%；隐丹参酮的峰面积的RSD为0.13%，仪器精密度良好。

2.5稳定性试验取“2.4”项下溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h时，精密量取10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果，对照品溶液放置24 h后，丹参酮ⅡA的峰面积的RSD为0.22%，隐丹参酮峰面积的RSD为0.21%，表明对照品溶液在24 h内基本稳定。

2.6定量限和检测限试验按信噪比为10∶1，测定本方法的定量限，按信噪比为3∶1测定本方法检测限。精密量取“2.3”项下储备液0.5 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取4.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为定量限溶液。

精密量取定量限溶液10 μL，注入液相色谱仪，连续进样6针，记录色谱图。结果：丹参酮ⅡA定量限溶液连续进样6针，峰面积和保留时间的RSD分别为3.23%和0.12%，丹参酮ⅡA的定量限为0.202 ng；隐丹参酮定量限溶液连续进样6针，峰面积和保留时间的RSD分别为4.67%和0.09%，隐丹参酮的定量限为0.202 ng。

精密量取“2.3”项下储备液0.5 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取1.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取5.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取3.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为检测限溶液。

精密量取检测限溶液10 μL，注入液相色谱仪，信噪比大于3∶1，可知丹参酮ⅡA的检测限为0.076 ng，隐丹参酮的检测限为0.077 ng。

2.7回收率试验精密称取隐丹参酮对照品10.45 mg，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为隐丹参酮对照品储备液。再精密称取丹参酮ⅡA10.13 mg，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为丹参酮ⅡA对照品储备液。

对照品溶液：精密量取隐丹参酮储备液2.5 mL和丹参酮ⅡA储备液2.5 mL，置同一个10 mL量瓶中，加甲醇稀释到刻度，摇匀，即得。

供试品溶液：精密称取已知含量的克痤隐酮凝胶样品6份，分别加入上述隐丹参酮对照品储备液3.0 mL和丹参酮ⅡA对照品储备液1.5 mL，加层析用硅胶(100～200目)10 g，拌匀，用乙醚湿法装入色谱柱(内径2.5 cm)中，用乙醚洗脱至色谱柱无色为止，收集乙醚洗脱液，挥干，残渣加甲醇使溶解，并定量转移至10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

精密量取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，试验结果见表1,2。由试验结果可知，丹参酮ⅡA的平均回收率为98.37%，RSD为0.45%；隐丹参酮的平均回收率为98.43%，RSD为0.31%，说明本法的准确度良好,见表1，2。

表1　丹参酮ⅡA回收率试验测定结果

表2　隐丹参酮回收率试验测定结果

2.8重复性对照品溶液：精密量取“2.7”项下隐丹参酮对照品储备液和丹参酮ⅡA对照品储备液各2.5 mL，置同一个10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液：取20140101批样品5 g，精密称定，加层析用硅胶(100～200目)10 g，拌匀，用乙醚湿法装入色谱柱(内径2.5 cm)中，用乙醚洗脱至色谱柱无色为止，收集乙醚洗脱液，挥干，残渣加甲醇使溶解，定量转移至10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，平行制备6份供试品。

精密量取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果：平行测定 6个样，丹参酮ⅡA含量的RSD为0.70%；隐丹参酮含量的RSD为0.60%，说明本方法重复性良好。

2.9中间精密度取20140101批样品，照“重复性”项下操作，由不同人于不同天配制相同浓度的供试品溶液和对照品溶液，并由该操作者进样分析。按拟定的方法，测定供试品中丹参酮ⅡA或隐丹参酮的含量。结果：不同天、不同人测得的12个样品中丹参酮ⅡA含量的 RSD为1.14%，隐丹参酮含量的RSD为0.68%，中间精密度良好。

2.10耐用性取20140101批样品，按拟定的方法,通过改变不同波长、流速、流动相比例、不同色谱柱、不同硅胶量，测定同一样品中丹参酮ⅡA或隐丹参酮的含量。试验结果见表3。由试验结果可知，改变波长、流速、流动相比例、色谱柱和层析用硅胶的量，丹参酮ⅡA的含量检测结果基本一致，隐丹参酮的含量测定结果也基本一致，说明该方法的耐用性较好。

表3　丹参酮粉含量测定耐用性试验测定结果/mg·g-1

2.11样品测定取本厂生产的克痤隐酮凝胶三批样品(批号： 20140501、20140601、20140602)，对隐丹参酮和丹参酮ⅡA分别进行含量测定，结果见表4。结果可知连续生产的样品检验结果重现性较好，产品质量较稳定。

表4　三批样品丹参酮粉含量测定结果/mg·g-1

3讨论

3.1关于流动相的选择在流动相的选择中，参考相关的文献[5-9]，经试验摸索，不断调整流动相的比例，使各色谱峰达到良好的分离效果，并能够节约进样时间，最终确定甲醇—水(85∶15)为最佳流动相条件。

3.2关于提取溶剂的选择在提取溶剂的选择中，参考相关的文献[5,10-13]，分别考察了甲醇、乙醚、无水乙醇∶氯仿(4∶1)3种溶剂，其中甲醇提取的检测回收率最低，乙醚与无水乙醇∶氯仿(4∶1)提取回收率差不多，但是乙醚挥干的速度最快，最终选用乙醚作为提取溶剂。

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HPLC determination of tanshinone powder in Kecuoyintong gel

CAI Li-juan1,2, ZANG Heng-chang1

(1.SchoolofPharmaceuticalSciences,ShandongUniversity,Jinan,Shandong250012,China；2.HefeiLifeonPharmaceuticalCo.,Ltd.,Hefei,Anhui230088,China)

Abstract:Objective To establish an HPLC method for the determination of tanshinone ⅡA and cryptotanshinone,thereby evaluating tanshinone powder in Kecuoyintong gel .Methods HPLC conditions: C(18) chromatographic column (250 mm×4.6 mm,5 μm); mobile phase：methanol-water (85∶15); flow rate: 1.0 mL·min(-1); wavelength:254 nm. Results For tanshinone ⅡA,in the concentration range of 5.04～100.80 mg·L(-1), the concentration C and peak area A showed a good linearity relationship(r=1.00),and the recovery rate was 98.7% (RSD=0.45%,n=6).For cryptotanshinone,in the concentration range of 5.04～100.87 mg·L(-1),the concentration C and peak area A showed a good linearity relationship(r=1.00),and the recovery rate was 98.43% (RSD=0.41%, n=6).Conclusions This method is sensitive，accurate and rapid,which can be used for quality control of content determination of tanshinone ⅡA andcryptotanshinone in Kecuoyintong gel.

Key words:HPLC;Kecuoyintong gel;tanshinone ⅡA;cryptotanshinone

(收稿日期：2015-02-10，修回日期：2016-01-15)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.04.011

作者简介:蔡丽娟，女，硕士研究生通信作者: 臧恒昌，男，教授，硕士生导师，研究方向：多糖类药物研究、药品生产工艺优化及在线过程分析与过程控制， E-mail:zanghcw@126.com