倒置荧光显微镜在医学研究生实验教学中的使用与管理

莫倩珍　刘静

摘要：科学研究的需要，使得倒置荧光显微镜在医学科研型研究生实验教学中的使用越来越普遍，因此正确使用和妥善管理显得尤为重要。本文从使用与管理角度加以讨论，总结了使倒置荧光显微镜更好地为实验教学服务的方法。

关键词：倒置荧光显微镜；实验教学；正确使用；妥善管理

中图分类号：G647 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2016）16-0261-02

倒置荧光显微镜是近代发展起来的新式荧光显微镜，其由倒置显微镜和落射荧光装置组成，具有在培养皿或培养瓶内进行显微观察的特点，可实现活体细胞和组织、流质、沉淀物等的相差、荧光观察是科学研究工作中的理想仪器。所以，在医学科研型研究生的实验教学中，掌握倒置荧光显微镜的使用至关重要，只有正确的使用和妥善的管理倒置荧光显微镜，才能发挥它的功能和提高使用率，使之更好地为实验教学和科学研究服务。

一、倒置荧光显微镜的正确使用

倒置荧光显微镜是用于高端生物科学研究领域的多功能显微镜，其结构复杂且价格昂贵，因此，要想医学研究生正确掌握倒置荧光显微镜的操作使用规范，教师得首先在示范倒置荧光显微镜的实际操作之前，开设学习倒置荧光显微镜基本知识的课程，介绍倒置荧光显微镜的结构、原理、功能和基本使用方法，再在具体的使用操作中，针对不同的标本，示范不同的功能，由浅入深，逐渐使医学研究生对倒置荧光显微镜的操作使用规范化。

1.明视野观察的正确使用。倒置荧光显微镜的功能之一是明视野观察，其基本原理是标本经光线照射后，各部分对光吸收的不同而在明亮的背景中实现成像，主要适用于经染色或本身具有颜色的细胞、组织切片等标本的观察。其基本步骤为：①打开外置白光电源供电器开关和倒置荧光显微镜左侧的白色按钮开关；②通过倒置荧光显微镜的左侧光强调节旋钮，调整到合适的照明亮度；③确认照明支柱上方的NCB11、ND、D滤光片推进光路；④旋转倒置荧光显微镜右侧的旋钮，使光路处于“EYE”位置；⑤调节目镜筒瞳距和屈光度；⑥旋转聚光镜转盘，将“A”档移入光路；⑦放置切片标本，通过旋转对焦手轮对标本进行聚焦；⑧用所需的放大倍数物镜观察标本。明视野观察是所有显微镜具备的功能，普通应用于科学研究中。医学研究生由于本科毕业于不同的院校，文化背景参差不齐，对显微镜的掌握程度不同，因此教师在实验教学过程中很有必要再次向他们灌输良好的使用习惯。另外，还要向他们讲解常见问题出现时应采取的策施。例如，接通电源开关而灯不亮时，可检查亮度控制按钮是否打开、电源线是否接触良好、灯泡是否烧坏；视场图像模糊时，可通过逐步移动物镜、目镜和载玻片来寻找原因；旋转亮度调节旋钮而亮度无变化时，可检查控制线是否正确连接。

2.相差观察的正确使用。倒置荧光显微镜的功能之二是相差观察，其基本原理是将样本不同部分的光程差转变为振幅差，经过带有相位片的相差物镜和带有环状光阑的聚光镜实现观测，主要适用于活细胞或不染色的组织切片观察。其基本步骤为：①打开外置白光电源供电器开关和倒置荧光显微镜左侧的白色按钮开关；②通过倒置荧光显微镜的左侧光强调节旋钮，调整到合适的照明亮度；③确认照明支柱上方的NCB11、ND、D滤光片推进光路；④旋转倒置荧光显微镜右侧的旋钮，使光路处于“EYE”位置；⑤调节目镜筒瞳距和屈光度；⑥旋转聚光镜转盘，将合适的相差环转入光路（4X对应PHL，10X/20X对应PH1，40X对应PH2）；⑦放置细胞标本，通过粗微调机构对标本对焦；⑧用所需的放大倍数物镜观察标本。在实验教学过程中，除了正确引导医学研究生遵守相差观察的基本操作方法，同时更为重要的是引导他们对使用相差观察的标本认识和掌握。对他们来说，在日后的科学研究中，最为常用的是培养细胞的显微观察。但是学生在初入研究生阶段，可能对培养细胞的器材和细胞形态没有完整的认识，甚至都未真正接触，从而不能完全找到正确的视野和正确掌握相差观察的使用。这就要求教师在教学过程中明确地为研究生讲解细胞标本的制备方法，并告诉他们在观察时应注意的问题。首先，对于细胞器材的选择，一般建议使用玻璃材质和塑料材质的培养皿、培养板和培养瓶。它们多为无色透明，可直接在倒置荧光显微镜上进行观察，不用倒掉细胞液和经过其他处理。其次，在进行显微观察中，不要随意打开器材的盖子，以免污染细胞。最后，对于操作人员来说，需佩戴手套、口罩和白大衣，不仅可以保护自身健康而且可以防止细胞污染。

3.荧光观察的正确使用。倒置荧光显微镜的功能之三是荧光观察，其基本原理是利用激发光激发样本产生荧光，從而实现样本的形状与定位观察，主要适用于荧光标记样本的观察。其基本步骤为：①通过相差观察步骤找到标本对焦；②打开外置荧光供电器电源开关，长按激发按钮激发汞灯；③通过关闭倒置荧光显微镜左侧的白色按钮开关来关闭白光；④确认荧光的视场光阑、孔径光阑、供电器上的SHUTER光闸全部打开；⑤确认荧光供电器上的ND旋钮在1位置、荧光滤色块转盘上的荧光光闸在O位置；⑥旋转荧光滤色块转盘，使合适的荧光滤光块进入光路；⑦用所需的放大倍数物镜观察标本。荧光观察是倒置荧光显微镜的重要功能，其配件昂贵且使用特殊。要想医学研究生正确地掌握荧光观察的操作使用规范，教师除了教会他们掌握基本的操作方法，同时更为重要的是教会他们掌握它的特殊性。首先，在标本制作中，载玻片和盖玻片应表面光洁且厚度适宜（载玻片在0.8mm～1.2mm之间，盖玻片在0.17mm左右）；标本应厚度适宜，同时避免细胞重叠或杂质掩盖；封裱剂应使用甘油和碳酸盐缓冲液（0.5mol/L PH9.0～9.5）的等量混合液。其次，在荧光观察前，应关闭房间内的电灯和倒置荧光显微镜的白光，确保处于暗室环境。最后，在荧光观察中，应严格控制观察时间，一般以1～2小时/次为宜，否则荧光会出现衰减和消失的现象；调整光源时应佩戴防护眼镜，避免紫外线对眼镜的伤害。

4.图像拍摄的正确使用。在科学研究中，不仅要求倒置荧光显微镜可以实现多种观察，而且要求倒置荧光显微镜可以实现图像拍摄。倒置荧光显微镜系统通过光电转换将光学显微镜与计算机结合在一起，不仅可以在目镜上进行显微观察，而且可以在计算机上进行实时动态图像的观察、编辑和保存。其基本步骤为：①打开电脑，插入软件加密锁；②打开桌面软件NIS-ELEMENTS；③倒置荧光显微镜的显微镜右侧旋钮，使光路切换至“L”位置，即光路进入相机；④点击“预览图标”，显示live实时图像；⑤选择合适的曝光时间和合适的拍照区域；⑥点击“标本图标”，确认当前物镜倍数是否与软件一致；⑦点击拍照按钮，保存图像。在实验教学中，教师除了教会医学研究生正确使用倒置荧光显微镜的三种观察，还要教会他们如何使用拍照和编辑功能。而在拍照中，应重点强调光路的切换。根据以往的教学经验，总发现不少研究生未将光路切换至“L”位置就直接进行拍照。另外，还要强调软件加密锁的重要性，告诫他们千万不要损坏和丢失，因为它不仅价格昂贵，而且是图像拍摄和数据分析的关键。

二、倒置荧光显微镜的维护与管理

1.倒置荧光显微镜的维护。首先，在使用倒置荧光显微镜前，应检查仪器是否良好、环境是否清洁干燥、仪器是否无振动和磁场干扰以及无阳光或紫外消毒灯照射。确认无误后，轻轻掀开防尘罩，在固定的位置上进行观察，不要轻易搬动。同时，操作人员与倒置荧光显微镜应保持一定的距离，以免发生撞碰。其次，在使用倒置荧光显微镜过程中，应当严格遵守各个功能的操作使用规范，正确掌握开机顺序（先开显微镜，再开相机电源，最后开电脑）和关机顺序（先关电脑，再关相机电源，最后关显微镜），做到不使用荧光不开启荧光光源、不拍照不开启电脑；注意避免频繁开关荧光灯，接通电源和关闭电源的间隔时间不少于30分钟，以保证荧光汞灯的正常使用寿命；禁止在系统电脑上连接网线和插入U盘或移动硬盘，以免电脑中毒；不得随意拆取物镜、目镜、荧光滤色片等光学部件，不得随意调节对中旋钮以免使光路产生偏差，不得大角度曲折荧光光纤以保持自然弯曲，不得使用暴力操作各仪器部件，不得在电源接通或开启情况下打开灯箱更换灯泡。最后，使用倒置荧光显微镜结束后，除荧光观察外，应及时关掉电源，使用乙醚和无水乙醇的混合液（掺和比例为7∶3）擦拭光学表面，保持倒置荧光显微镜的干燥和清洁；不得使用镜头纸以外的硬物擦拭镜头以免损坏镜头镀膜；若使用图像拍摄功能，应正确退出软件加密锁后，再按正确程序关闭电脑；灯箱冷却后方可盖上防尘罩，以免烧坏仪器和发生火灾。

2.倒置荧光显微镜的管理。由于医学研究生众多，而倒置荧光显微镜稀少，因此妥善的管理显得尤为重要。它不仅可以防止倒置荧光显微镜的损坏，而且可以提高倒置荧光显微镜的使用率。我们可以采取以下管理方案：①先學后用制，即研究生先经过课堂和实验教学的学习，正确掌握使用方法后才可以使用；②使用登记制，即研究生使用后，需详细记录使用情况，记录中应包括使用时间、使用人员、使用哪种功能和仪器有无异常，具有可追溯性；③专人管理制，即设定专门的管理人员，负责仪器的保管，负责仪器的使用安排，定期对仪器进行检查和保养；④档案设定制，即由仪器管理人员建立仪器档案，内容主要包括使用说明书、生产厂家、生产日期、购置日期、维护和维修记录等。

参考文献：

[1]程静华，李平，容哲.形态实验教学中显微镜存在的问题及处理[J].医疗卫生装备，2009，30（10）：121-122.

[2]严家来，方安宁，陈雨京.课堂实验教学中生物光学显微镜使用的不规范操作及正确做法[J].高教高职研究，2015，（67）：156.