甘薯薯块DNA提取方法研究

张道微，张超凡，董 芳，黄艳岚，张 亚，周 虹（.湖南省作物研究所，湖南 长沙 405；.中南大学研究生院隆平分院，湖南 长沙 405）



甘薯薯块DNA提取方法研究

张道微1，张超凡1，董 芳2，黄艳岚1，张 亚1，周 虹1
（1.湖南省作物研究所，湖南 长沙 410125；
2.中南大学研究生院隆平分院，湖南 长沙 410125）

摘 要：甘薯薯块富含淀粉、酚类等物质，不利于DNA提取。为了研究甘薯薯块DNA提取的最佳方法，采用经典CTAB 法、改良 CTAB 法一、改良 CTAB 法二和 SDS 提取法，对甘薯薯块总DNA提取效果进行比较，以试剂盒法提取结果作对照。结果表明：采用经典CTAB提取法和SDS提取法获得的薯块DNA含有较多杂质，且降解严重，样品质量低；CTAB改良法一能降低DNA样品中多糖等物质的含量，但DNA存在一定程度降解，且耗时较长；CTAB改良法二提取效果最佳，杂质含量低且DNA降解少，与试剂盒提取效果最接近，是一种较为理想的甘薯薯块DNA提取方法。

关键词：DNA提取；CTAB提取法；SDS提取法

甘薯是我国主要粮食作物之一，我国甘薯栽培面积和总产仅次于水稻、小麦和玉米，居第四位。甘薯的用途广泛，可广泛用于食品、医药、化工、造纸等10多个行业，加工成数百种工业产品和数百种食品；同时，甘薯也是重要的新型能源用块根作物，单位面积能量产量达435 MJ/(hm2·d)，远高于马铃薯、大豆、水稻、木薯和玉米等作物，是生产燃料乙醇的理想原料。资料显示，以干物质计，甘薯的粗淀粉含量为37.6%～77.8%，粗蛋白含量为2.24%～12.21%，可溶性糖含量为1.68%～36.02%，而鲜薯的胡萝卜素含量最高可达208.1 mg/kg[1]。

目前，甘薯育种多采用集团杂交的方式进行，由于父本遗传背景还不完全明确，不利于种质资源的分析和管理，也对进一步利用种质资源造成阻碍[2]。近年来，国内外对甘薯开展了较好的基础研究，对甘薯进行分子标记等分析，有助于更好地了解其遗传基础，为育种提供参考。

育种工作中，甘薯的性状主要通过种薯传递到下一代，而在做分子标记分析时，目前多采集甘薯茎叶做样品来提取DNA，以甘薯薯块为样本的试验开展极少，这与高质量提取新鲜薯块DNA样品的技术不成熟有关。甘薯薯块由于富含糖类、酚类等物质[1]，较难获得高质量的DNA样品，研究采用经典CTAB法、改良 CTAB 法一、改良 CTAB 法二和 SDS 法对甘薯薯块总DNA的提取效果进行比较，并以DNA提取试剂盒法作对照，以期筛选提取甘薯高质量DNA的最佳方法，为甘薯遗传多样性分析、薯块病毒DNA检测等研究提供基础。

1　材料与方法

1.1试验材料

以高淀粉品种徐薯22为供试材料，选取健康无破损的新鲜薯块为样品，清洗干净，于薯块中间位置取样，每个样品重约0.5 g，切碎成小片，采用液氮研磨成粉，收集样品进行DNA提取。对照组中，以新鲜健康甘薯叶片为样品，每个样品取0.5 g。

1.2试验设计

每种提取方法做3次重复，对每一个样品DNA纯度进行检测，最终结果取其平均值。

1.2.1经典CTAB法 取0.5 g块根切碎，放入研钵液氮研磨，转移至1.5 mL离心管（下同）中，加1 mL 65 ℃预热的2% CTAB 提取缓冲液震荡混匀，65℃水浴 30 min，每隔10 min 轻轻颠倒混匀一次；12 000 r/min离心10 min，取上清液至另一个离心管，加入等体积氯仿/异戊醇（体积比24∶1）溶液，反复混匀，使管内溶液呈乳浊状，12 000 r/min离心10 min；取上清液至新的离心管中，加入等体积无水乙醇，轻轻混匀，-20℃放置至白色絮状沉淀出现，10 000 r/min离心10 min，弃上清液，用0.5 mL 75%的乙醇洗涤两次，7 000 r/min离心2 min，弃上清液，置于空气中干燥；沉淀物干燥后溶于100 μL 的TE溶液，-20℃冰箱保存备用[3-4]。

1.2.2改良CTAB法一 取薯块0.5 g放入研钵中，加入少许石英砂和PVP，加入1 mL缓冲液[内含100 mmol/L Tris-HCL（pH值 8.0）、50 mmol/L EDTA （pH 值8.0）、700 mmol/L NaCl、2% PVP（聚乙烯吡咯烷酮，W/V）、2%β-巯基乙醇（V/V）]，置于离心管中；10 000 r/min 离心10 min，弃上清液；加入 600 μL 65℃预热的CTAB提取缓冲液和25 μL β-巯基乙醇，震荡混匀；65 ℃ 水浴60 min，每隔15 min轻轻颠倒混匀；冷至室温后，加入 240 μL KAc（5 mol/L），放入-20℃冰箱l h；10 000 r/min离心10 min；小心移取上清至另一只干净的离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇（24∶1）振荡混匀，10 000 r/min离心10 min；取上清至另一个离心管中，加入预冷的异丙醇 640 μL ，放入-20 ℃ 冰箱l h；10 000 r/min离心 10 min，沉淀DNA，清洗和保存同经典CTAB 法。

1.2.3改良CTAB法二 样品处理方法和改良方法一相同，加入CTAB提取缓冲液和β-巯基乙醇65 ℃水浴1 h，12 000 r/min离心10 min，取上清加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）溶液，震荡混匀后12 000 r/min离心10 min，小心吸取上清，加入等体积氯仿/异戊醇（24∶1）振荡混匀，12 000 r/ min离心10 min，取上清加入500 μL预冷的异丙醇，放入-20 ℃ 冰箱l h；10 000 r/min离心10 min，沉淀DNA，清洗和保存同经典CTAB法。

1.2.4SDS法 取 0.5 g 薯块切碎置于研钵，加人1 mL 3% SDS 提取缓冲液，充分研磨成粉末，装入离心管中65 ℃水浴60 min，每15 min颠倒混匀一次；冷却至室温加入 230 μL KAc（5 mol/L），颠倒混匀后冰浴60 min；10 000 r/min 离心10 min，取上清加等体积氯仿/异戊醇（24∶1）溶液，震荡混匀后 10 000 r/ min 离心10 min；取上清液加入预冷的异丙醇600 μL溶液混匀，放入-20 ℃冰箱l h；10 000 r/min 离心10 min，沉淀 DNA；清洗和保存同经典CTAB 法。

1.2.5试剂盒提取 采用TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型，目录号：DP305）提取甘薯叶片DNA，按照说明书步骤操作。

1.3DNA 质量检测

取4 μL DNA 提取液用超纯水稀释200倍后，在紫外分光光度计上测量OD260/OD280的比值；取5 μL DNA 样品在1%的琼脂糖凝胶上电泳，制胶前加入核酸染料Goldview，结束后用凝胶成像仪拍照。

1.4SSR 标记分析

为验证提取的DNA样品在分子标记试验中的适应性，以提取的DNA样品为模板进行分子标记，以上海生工合成的SSR引物（F：5'-CCAGTTCAAATCTG GGTGTC-3'；R：GGGATTGTAGTTCAATTGGT-3'）进行扩增，方法参照张超凡[5]博士论文。

2　结果与分析

2.1DNA提取结果分析

从图1中可以看出，植物基因组DNA提取试剂盒对甘薯叶片DNA提取有较理想的效果，可以看到清晰的条带，且DNA降解程度很低，没有明显拖带现象；与之比较，该试剂盒对甘薯薯块DNA的提取产量有所降低，条带不够明亮。其他方法中，CTAB改良法二的效果与试剂盒提取结果最接近，而经典CTAB法提取的DNA存在明显降解，泳道最前端有大量降解DNA存在，CTAB改良法一也存在一定程度的DNA降解现象；SDS提取法的结果与CTAB改良法一结果较接近。

图1　采用不同方法提取的甘薯基因组DNA（1、2：试剂盒提取的叶片DNA；3、5：空白；4：1 kb ladder DNA mark；6：试剂盒提取；7：SDS法提取；8：CTAB改良法二提取；9：CTAB改良法一提取；10：经典CTAB法提取；6～10材料为薯块）

由表1可知，甘薯薯块DNA的取产量明显低于叶片DNA，试剂盒提取也不能显著提高甘薯薯块DNA的产量，试验中5种薯块DNA提取方法的产量比较接近，无明显差别，其结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致。OD260/OD280的值代表DNA的纯度，纯DNA的OD260/OD280值接近1.8。比值大于1.9，表明有RNA污染；比值小于1.6，表明有蛋白质、酚等污染。经典CTAB法和SDS法提取的甘薯薯块DNA均存在一定程度蛋白质、苯酚等物质污染，CTAB改良法一存在一定程度RNA等物质污染。相对于试剂盒提取结果，CTAB改良法2提取薯块DNA效果与之最接近。

表1　薯块DNA提取产量分析

2.2SSR分子标记克隆检验

如图2所示，以不同方法提取的甘薯薯块DNA做模板，都能获得PCR产物，其中以试剂盒提取和CTAB改良法二提取的DNA为模板所获得PCR产物在琼脂糖凝胶电泳时条带更亮，说明其克隆效率最高。

图2　甘薯薯块基因组DNA单一SSR引物PCR扩增结果

综合以上结果可以发现，CTAB改良法二提取的薯块DNA质量最接近试剂盒法提取的。且比较提取单个样品消耗的时间（表2）可知，CTAB改良法二消耗的时间居中。综合来看，采用该方法既能保证获得较高质量的DNA产物，又能替代试剂盒使用，节约成本，是一种较为理想的甘薯薯块DNA提取方法。

表2　单个样品不同提取方法消耗时间

3　讨 论

组织DNA提取是许多分子试验的基本环节，甘薯薯块由于富含淀粉、酚类等物质，不容易提取出高质量的DNA。从试验结果可以看出，采用经典CTAB法提取薯块DNA，电泳检测时点样孔处有DNA条带出现，可能是由于DNA中含有淀粉等物质造成的。试验中采用的5种提取方法都尚未达到最佳效果，但是相对于试剂盒提取，CTAB改良法二提取获得的DNA质量最佳。

试验中，将薯块研磨成粉末，加入CTAB或者SDS提取缓冲液65℃水浴后，由于淀粉等物质的存在，均有不同含量的黏稠物质形成，粘稠物质越多，随后离心获得的DNA样品中蛋白含量也就越多，这严重影响DNA样品的质量。所以，在实际操作中，取样量与提取缓冲液的比例也是影响DNA提取结果的重要因素。为了从甘薯薯块中得到更多的DNA，可以考虑每个样品处理为两管，层析后，在DNA沉淀步骤时再整合到一个离心管中。

CTAB改良法中，由于PVP能与酚类形成不溶性物质，β-巯基乙醇能抑制酚类物质的氧化，两者结合处理离心后，能有效降低样品中酚类物质的含量[6]。加入高浓度盐，能提高淀粉在乙醇中的溶解度，也是降低样品中淀粉含量的有效办法之一[7]。此外，CTAB改良法二由于增加了苯酚/氯仿/异戊醇的层析步骤，也有效减少了样品中的杂物质，而异丙醇对DNA的沉淀效果，比经典CTAB提取法中乙醇的沉淀效果要好。

参考文献：

[1] 张超凡，周 虹，黄艳岚，等. 甘薯马铃薯高产栽培新技术[M].长沙：湖南科学技术出版社，2014. 4-5.

[2] 张道微，张超凡，董 芳，等. 中国甘薯遗传系谱分析[J]. 湖南农业科学，2015，（11）： 1-6 .

[3] 顾红雅. 植物分子生物学实验手册[M]. 北京：高等教育出版社，1998. 4-11．

[4] 杨维泽，史云东，许宗亮，等. 药用植物珠子参新鲜块根DNA提取方法研究[J]. 云南中医学院学报，2014，（37）：25-28.

[5] 张超凡. 湖南甘薯品种遗传多样性分析[D]. 长沙：中南大学，2010.

[6] 包英华，白 音. 美花椒. 石斛基因组DNA提取方法研究[J]. 热带亚热带植物学报，2007，26（3）：147.

[7] Wulf E，Tortes S，Gonzales-Vigil E. Protocol for DNA extraction from potato tubers[J]. Plant Mol Biol Rep，2002，20（2）：187a.

（责任编辑：成 平）

Study on Extraction Method of DNA from Sweet Potato Tuber

ZHANG Dao-wei1，ZHANG Chao-fan1，DONG fang2，HUANG Yan-lan1，ZHANG Ya1，ZHOU Hong1
（1.Hunan Crop Research Institute， Changsha 410125， PRC；
2. Longping Branch of Graduate School of Central South University， Changsha 410125， PRC）

Abstract：Potato tuber is rich in starch, phenol and other substances, which is not conducive to DNA extraction. In order to study the best extraction method of sweet potato tuber DNA, using the classical CTAB method, improved CTAB method-1, improved CTAB method-2 and SDS extraction method, to compare the sweet potato tuber total DNA extraction effect, use the extraction result of kit method as control. The results show that the classic CTAB extraction method and SDS extraction method contains more impurities, serious degradation and the quality of sample is low; the improved CTAB method-1 can reduce the content of polysaccharide and other substances in DNA samples, but DNA has a certain degree of degradation, and it consumes too much time; the improved CTAB method-2 has best extraction effect, low content of impurities and degradation of DNA, the closest extraction effect to kit method, is an ideal method for extracting DNA from sweet potato tuber.

Key words：DNA extraction; CTAB extraction method; SDS extraction method

通讯作者：张超凡

作者简介：张道微（1987-），男，湖南武冈市人，助理研究员，主要从事甘薯育种工作。

基金项目：国家甘薯产业技术体系（CARS-11-C-16）

收稿日期：2016-02-04

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.04.002

中图分类号：Q946-33

文献标识码：A

文章编号：1006-060X（2016）04-0005-03