外周血自然调节性T细胞和主动脉TNF-α在动脉粥样硬化发展中的表达

罗非同，郝春艳，段虎斌，滕萍萍，陈　青，易　琴

外周血自然调节性T细胞和主动脉TNF-α在动脉粥样硬化发展中的表达

罗非同，郝春艳，段虎斌，滕萍萍，陈青，易琴

山西医科大学第一临床医学院(太原 030001)，E-mail：352425011@qq．com

摘要：目的探讨外周血自然调节性T细胞(natural regulatory T cell，nTreg)和主动脉肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)α表达在动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)发展中的免疫调节作用。方法雄性SD大鼠36只，体重100 g±10 g，随机分3组，每组12只。健康对照组(A组)、早期动脉粥样硬化组(B1组)、晚期动脉粥样硬化组(B2组)。采用高脂高糖饮食配合腹腔注射维生素D3针剂建立大鼠AS模型。流式细胞仪检测各组大鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比例，免疫组化检测大鼠主动脉根部TNF-α表达。结果A组大鼠主动脉根部未见斑块形成，B1组大鼠主动脉根部可见纤维斑块形成，B2组大鼠主动脉根部可见粥样斑块形成。B1、B2组大鼠血管TNF-α表达较A组上调(P<0．05)。B1组大鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比例较A组、B2组降低(P<0．05)。结论外周血nTreg在AS不同时期的变化，可能与TNF-α调节有关。

关键词：动脉粥样硬化；肿瘤坏死因子α；自然调节性T细胞；大鼠

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的产生是动脉内膜的一个慢性炎症过程。最近，人们认为此炎症过程被斑块抗原介导的免疫反应调节。自然调节性T细胞(natural regulatory T cell，nTreg)在胸腺中产生，其代表为CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞，是一种重要的免疫抑制细胞，对维持机体免疫稳态和抑制自身免疫反应有重要作用。肿瘤坏死因子(TNF)-α是一种多效性细胞因子，具有促炎和免疫抑制双重效应。TNF的生物学功能是通过两种在结构上相关，但功能不同的肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor Receptor，TNFR)1和TNFR2介导。其中，TNFR2主要介导淋巴细胞的激活和增殖信号[1]。人和老鼠的调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)显著表达TNFR2，跨膜型TNF较分泌型TNF可更有效的激活TNFR2[2]，使TNF增强Treg活性成为可能。本研究探索AS大鼠外周血nTreg比例与主动脉TNF-α表达在疾病不同阶段的变化，探讨nTreg和TNF-α在AS发病过程中的免疫调节作用。

1材料与方法

1．1材料流式细胞仪(FACSCalibur型，美国Becton Dickinson公司)，图像分析系统(BI 2000医学图像分析系统，中国成都泰盟软件有限公司)，抗鼠CD4 FITC、抗鼠CD25 PE、抗鼠Foxp3 APC(美国eBioscience公司)，淋巴细胞分离液(北京索莱宝科技有限公司)，兔抗人，大鼠，小鼠TNF-α多克隆一抗(博士德，武汉)，即用型SABC-POD(兔IgG)试剂盒(博士德，武汉)。维生素D3注射液(上海通用药业股份有限公司)，丙基硫氧嘧啶片(上海朝晖药业有限公司)。

1．2实验动物及分组4周龄健康雄性SD大鼠36只，体重100 g±10 g，由山西医科大学实验动物中心提供。随机分两组：健康对照组(A组12只)、动脉粥样硬化组(B组24只，分成2个亚组，分别为B1组、B2组)。

1．3实验步骤

1．3．1造模及标本采集A组喂普通饲料5个月。B1、B2组喂高脂高糖饲料(3%胆固醇、0．5%猪胆盐、10%猪油、5%白糖、0．2%丙基硫氧嘧啶、5%蛋黄粉、76．3%基础饲料)，喂养时间分别为3个月、5个月。动脉粥样硬化组实验开始时一次性腹腔注射维生素D3针剂6×105IU/kg，并于造模第1周、2周、3周各补充腹腔注射维生素D3针剂1×105IU/kg，动物自由饮水，建立AS大鼠模型。各组大鼠于喂养结束时间点采用20%乌拉坦0．5 mL/100 g腹腔注射全身麻醉，腹主动脉采血后处死，血液储存于EDTA抗凝管中用于流式细胞术检测。制作主动脉根部病理切片，用于HE染色及免疫组化实验。

1．3．2染色及图像采集主动脉根部标本石蜡包埋，4 μm连续切片。HE染色：常规脱蜡、水化，行HE染色，光镜下对比观察各组主动脉根部形态学变化。免疫组化染色：二甲苯脱蜡，系列乙醇浸泡水化，3%过氧化氢室温孵育10 min，枸橼酸盐缓冲液抗原热修复2 min，加5%BSA封闭液，37℃孵育30 min。加1∶50稀释的兔抗人，大鼠，小鼠TNF-α多克隆一抗，4℃过夜。滴加生物素标记山羊抗兔IgG，室温孵育30 min。滴加SABC，室温孵育30 min。DAB显色，显微镜下控制显色程度。使用BI 2000医学图像分析系统测定平均灰度值。

1．3．3流式细胞仪(FCM)检测取1．5 mL EDTA抗凝血，加入1．5 mL PBS液，吹打均匀。取15 mL离心管，加入3 mL淋巴细胞分离液，沿管壁缓慢加入等体积的上述稀释抗凝血，1 500 r/min离心20 min。用移液器取出第二层环状乳白色淋巴细胞层，置入新的离心管中，加PBS液吹打均匀后1 000 r/min离心4 min，弃上清。加入Anti-Rat CD4 FITC 1 μL，Anti-Rat CD25 PE 4 μL，室温避光20 min。加1 mL新鲜配制的固定/破膜液，混匀，4℃避光孵育28 min。加入2 mL新鲜配制的破膜缓冲液，1 000 r/min离心4 min，弃上清。重复一次。加4 μL抗鼠Foxp3 APC，混匀，室温避光孵育30 min。加入4 mL 破膜缓冲液，1 000 r/min离心4 min，弃上清，加上机Buffer流式细胞仪分析。

2结果

2．1大鼠主动脉病理变化光镜下可见A组大鼠主动脉内膜光滑，血管壁无斑块形成。B1组大鼠主动脉可见隆起于动脉内膜表面的斑块形成，斑块表层为纤维结缔组织，此为早期斑块，即纤维斑块期。B2组大鼠主动脉可见纤维帽下脂质及肌纤维崩解坏死产物增多，为晚期斑块，即粥样斑块期。

2．2免疫组织化学染色结果主动脉TNF-α表达关系：B1组>B2组>A组，B1、B2组与A组差异有统计学意义(P<0．05)，其余各组间差异均无统计学意义，详见表1。光镜下A组大鼠主动脉未见明显TNF-α棕黄色颗粒表达。B1组、B2组大鼠主动脉内皮细胞和平滑肌细胞的胞浆中可见颜色为棕黄色TNF-α阳性颗粒表达，二者表达差异并不明显。

表1　主动脉TNF-α平均灰度值(±s)

2．3流式细胞仪分析结果B1组大鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞占CD4+T细胞比例低于A组和B2组大鼠(P<0．05)。详见表2。

表2　大鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性

3讨论

Treg可抑制Th1/Th17介导的炎症反应，以及减弱树突细胞抗原提呈作用，发挥抗AS作用。根据其来源可分为nTreg和诱导性调节性T细胞(induced regulatory T cell，iTreg)。TNF-α来源广泛，包括各种免疫细胞、内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞等。TNF-α上调被认为是炎症反应的基准。当TNF-α作用于血管内皮细胞，可导致血管损伤和血栓形成。然而，近年来大量研究表明，TNF可以通过TNFR2受体激活和增加Treg。如有学者发现，在体外，与IL-2协同下，TNF-α可选择性的激活老鼠 Treg，使其增殖和上调转录因子Foxp3的表达，促进其抑制作用[3]。体外利用TNF孵化共培养的Tregs和效应性T细胞(effector T cells，Teffs)，在较短时间(48 h)，可部分逆转Treg对Teffs的抑制活性。然而经过较长的孵育时间(72 h)，Treg抑制活性恢复[4]。这些数据说明在炎症反应早期，虽然有Treg的存在，但TNF可降低Treg的抑制活性并促进Teffs增殖。然而，在TNF长期作用下，可恢复功能性Treg活性，并抑制Teffs的增殖。

本研究观察到在大鼠AS病变早期，外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比例降低，而在病变晚期升高并接近于健康对照组大鼠水平。主动脉TNF-α表达在AS病变早期、晚期并没有显著差异，均高于健康对照组大鼠。结合以往研究，本实验认为外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞水平在AS早、晚期阶段的变化，可能与TNF-α调节有关。研究表明，虽然TNFR2优先表达于Treg，但一小部分老鼠Teffs(<10%)和人外周血Teffs(约20%)也表达TNFR2，TNFR2在Teffs中的表达可以增强Teffs对Treg介导抑制效应的抵抗[5]。AS病变早期，TNF-α作用下，nTreg对Teffs抑制活性减弱，Teffs增殖，使外周nTreg相对减少[6]。病变晚期，优先表达在Treg上的TNFR2对保留Treg对炎症反应负反馈调节开始发挥重要作用，nTreg细胞对Teffs抑制活性恢复，外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比例升高，抑制炎症进一步发展，体现出机体免疫调节的一种重要负反馈机制。

参考文献：

[1]Grell M，Becke FM，Wajant H，et al．Tumor necrosis factor (TNF) receptor type 2 mediates thymocyte proliferation independently of TNF receptor type 1[J]．European Journal of Immunology，1998，28(1)： 257-263．

[2]Grell M，Douni E，Wajant H，et al．The transmembrane form of tumor necrosis factor is the prime activating ligand of the 80 kDa tumor necrosis factor receptor[J]．Cell，1995，83(5)： 793-802．

[3]Miller AM，McPhaden AR，Preston A，et al．TNFα increases the inflammatory response to vascular balloon injury without accelerating neointimal formation[J]．Atherosclerosis，2005，179(1)： 51-59．

[4]Chen X，Oppenheim JJ．TNF-alpha： an activator of CD4+FoxP3+TNFR2+regulatory T cells[J]．Curr Dir Autoimmun，2010，11：119-134．

[5]Chen X，Bäumel M，Männel DN，et al．Interaction of TNF with TNF receptor type 2 promotes expansion and function of mouse CD4+CD25+T regulatory cells[J]．The Journal of Immunology，2007，179(1)： 154-161．

[6]Chen X，Hamano R，Subleski JJ，et al．Expression of costimulatory TNFR2 induces resistance of CD4+FoxP3 conventional T cells to suppression by CD4+Foxp3+regulatory T cells[J]．The Journal of Immunology，2010，185(1)： 174-182．

(本文编辑王雅洁)

Peripheral Blood Natural Regulatory T Cells and the Expression of TNF-α in Aortas during the Progression of Atherosclerosis

Luo Feitong，Hao Chunyan，Duan Hubin，Teng Pingping，Chen Qing，Yi Qin

The First Clinical school，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，Shanxi，China

Abstract：ObjectiveTo explore the immune regulation effect of peripheral blood natural regulatory T cell(nTreg) and the expression of tumor necrosis factor(TNF)-α in aortas during the progression of atherosclerosis(AS)．Methods Thirty-six male Sprague-Dawley (SD) rats (body weight 100 g±10 g) were randomly divided into，healthy control group (group A)，early stage atherosclerosis group (group B1)，late stage atherosclerosis group (group B2) ，each group had 12 rats．Rat atherosclerosis models were established by treating rats with celiac injection of vitamin D3 accompanied by high sucrose-high fat diet in this experiment．The frequency of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cell in peripheral blood was measured by fluorescence-activated cell sorter(FACS)in each group．Aortas were observed with HE staining for pathological changes．The expression of TNF-α in the rat aortic roots was detected by immunohistochemical assay．ResultsThere was no plaque in the rat aortic roots in group A．There was fibrous plague in the rat aortic roots in group B1．There was atheromatous plague in the rat aortic roots in group B2．The expressions of TNF-α protein in the rat aortic roots in group B1 and group B2 wwre higher than those in group A(P<0．05)．Peripheral frequency of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cell was decreased in group B1 compared with those in group A and group B2(P<0．05)．ConclusionThe change of peripheral blood natural regulatory T cell may be associated with the TNF-α adjustment in different periods of atherosclerosis．

Key words：atherosclerosis；tumor necrosis factor α；natural regulatory T cell；rat

基金项目：2015年度山西省研究生教育创新项目(No．2015SY30)，山西医科大学2012年度博士启动基金(No．B03201217)；2013年山西省卫生厅科技攻关项目(No．201301068)；2013年度山西医科大学第一医院院基金(No．YG1303)

通讯作者：郝春艳，E-mail：13803494928@126．com

中图分类号：R543R285

文献标识码：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．03．013

文章编号：1672-1349(2016)03-0270-03

Corresponding Author：Hao Chunyan

(收稿日期：2015-08-25)