MiR200对肾癌细胞纤维化影响的相关性分析

施莹，林玲，阚佳音，刘海燕，马增伟，李双宇.齐齐哈尔医学院第三附属医院肾内科，黑龙江齐齐哈尔　6000；.齐齐哈尔医学院病理学院微形态实验中心，黑龙江齐齐哈尔　6000



MiR200对肾癌细胞纤维化影响的相关性分析

施莹1，林玲1，阚佳音1，刘海燕2，马增伟1，李双宇1
1.齐齐哈尔医学院第三附属医院肾内科，黑龙江齐齐哈尔161000；2.齐齐哈尔医学院病理学院微形态实验中心，黑龙江齐齐哈尔161000

［摘要］目的研究MiR200对肾癌细胞纤维化的影响机制，为鉴定治疗靶标提供理论依据。方法整群选取2013年1月—2015年1月该院收治的51例肾癌患者病例资料，于实验室，建立肾癌细胞株模型，采用癌旁正常组织作为对照，应用细胞侵袭实验和Westermblot法检测靶基因蛋白表达方法进行试验。结果MiR-200组在SN12-PM6和786-0平均穿膜细胞的个数差异有统计学意义（P＜0.05），MiR-200组ZEB1蛋白表达下降，而在E-cadberin蛋白表达上升，经相关系数比较，MiR-200的表达与E-cadberin成正相关（r=0.824）而ZEB1成负相关（r=-0.762）。结论MiR-200能够调节皮脂纤维化的侵袭，降低ZEB1蛋白表达，从而E-cadberin蛋白表达上升。

［关键词］MiR200；肾癌细胞；ZEB1；E-cadberin

随着人类基因组学的不断发展和重视，微小RNA已经越来越受到人们的重视，其功能和控制人类基因至少三分之一编码蛋白基因的表达。MicroRNA（miRNA）则是由长度19～25个核苷酸构成的非编码小分子RNA［1］。该研究于2013年1月—2015年1月整群选取入住该院肾癌患者51例病理资料为研究对象，就miRNA在肿瘤纤维化中发挥的作用的相关性进行研究，为肾癌的发展提供理论依据，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料

整群选取于2013年1月—2015年1月该院肾癌住院患者51例病理资料为研究对象，其中男性28例，女性23例，年龄43～78岁，平均年龄（62.63±4.89）岁，其中，中早期患者（局部进展性）39例，晚期患者（转移型肾癌）12例。所有患者均经病理学检查诊断为肾癌患者［3］，并未合并糖尿病等其他脏器功能障碍患者。并取得患者知情同意，经该院伦理委员会批准此项研究。

1.2细胞株

该研究选取肾癌组织和癌旁正常组织均来自该院肾脏外科手术切除样本。选取其癌细胞株786-O和 A498。肾癌细胞培养于DMEM培养基中，该培养基采用1％青-链霉素和10％胎牛血清构成，至于37℃中5％CO2和相对湿度90％环境下培养箱中保存，保障良好的细胞贴壁状态，根据细胞生长的情况进行2～4 d传代一次。

1.3方法

1.3.1细胞侵袭实验（1）包被基底膜：该研究采用培养液和50 mg/L Matrigel按体积8：1进行稀释配置，包被位于Transwell小室的室面上，采用4℃进行风干。（2）水化基底膜：在小室中吸出残余的液体，以孔为单位，每孔加入50 uL具有10 g/L BSA的无血清培养液。保持温度为37℃，持续时间为30 min。待细胞脱离血清处于饥饿状态12～24 h后在制备细胞悬液。（3）胰酶消化细胞，在消化终止后离心，去掉培养液，采用PBS进行洗涤，2次，再次使用BSA的无血清培养基培养，使之重悬，使细胞浓度控制在1×105/mL。取细胞悬液100 uL，加入Transwell小室中，在24孔板下室加入由10％胎牛血清构成的培养液500 uL，培养24 h。（4）细胞计数：先用棉签擦净上室内的细胞，采用0.1％的结晶紫染色，通过显微镜观察，随机选取5个视野，计数其平均数。

1.3.2Westermblot法检测靶基因蛋白表达（1）抗体：该研究抗体由Rabbbit polyclonal ZEB1、Rabbbit polyclonal E -cadherin、Rabbbit polyclonal β-Actin和Horseradish peroxidase -conjugate secondary goat anti -rabbit组成。（2）配置1XTris-甘氨酸电泳缓冲液，由18.8 g甘氨酸，3.03 g Tris，1 g SDS构成，使之蒸馏水溶解，配置成1 000 mL保存；配置转膜缓冲液，由2.9 g甘氨酸，5.8 g Tris，在使用前添加200 mL甲醇，依然配置1 000 mL，配置10XTBS缓冲液，由24.2 g Tris，80 gNa-Cl，配置1 000 mL，和1XTBS缓冲液，1XTBS缓冲液由10XTBS缓冲液稀释得到，所有缓冲液均室温保存。（3）采用6孔板进行细胞蛋白样品提取，每孔加入含有蛋白酶抑制剂和PMSF的蛋白裂解液150 uL，在冰上进行，上摇床震荡20 min，刮下细胞，放置在1.5 mLEP中，然后进行超声处理，在4℃环境下离心12 000 rpm，5 min后进行分装至于-80℃保存。（4）BCA法测定蛋白样品浓度：该操作方法严格按照试剂盒说明操作。然后经免疫反应和ECL化学发光和凝胶图像仪进行分析结果。

1.4统计方法

运用SPSS17.0统计软件进行录入、分析数据。计量资料采用（±s）表示，组间比较采用t检验进行统计推断，计数资料采用（n，％）表示，组间比较采用Χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1MiR-200抑制肾癌细胞侵袭能力分析

该结果通过Matrigel凝胶测量，观察两组24 h细胞穿透该凝胶的能力判断抑制癌细胞侵袭能力。MiR-200组在SN12-PM6和786-0平均穿膜细胞的个数分别为42和35，经Χ2检验，差异有统计学意义，均小于对照组，说明通过拮抗MiR-200可显著抑制肾癌细胞的侵袭能力。见表1。

表1　两组细胞侵袭能力比较

2.2MiR-200调控ZEB1和E-cadberin表达情况比较

根据Wwsternblot结果显示，MiR-200组ZEB1蛋白表达下降，而在E-cadberin蛋白表达上升，详见表2。经相关系数比较，MiR-200的表达与E-cadberin成正相关（r=0.824）而ZEB1成负相关（r=-0.762）。

表2　MiR-200调控各指标表达情况（Relative levels of miRNA）

3　讨论

临床资料显示［4］，20％～30％在患有肾癌时已经出现远处转移，直接导致治疗效果不佳，直接影响患者生存质量。上皮-间质转化（EMT）是导致了转移的重要依据，它是通过上皮细胞特定的形态学增生繁殖的过程，加快了肿瘤的发生与发展，通过组织重建的生理现象，直接导致了组织纤维化的病理过程，从而进一步加速了肿瘤的侵袭。Honeyman研究表明［6］，E-钙黏蛋白（E-cadberin）是细胞间的粘附分子，对细胞间的连接，阻止细胞侵袭起到了至关重要的作用，它的表达水平下降直接导致粘附能力下降，使细胞间连接受到阻碍，从而促进了肿瘤细胞的侵袭。这与该研究得到结论一致。该研究也为证实E-cadberin在肾癌细胞中也有表达，表达量分别为0.99和1.07，得到了一致的结果。该研究显示，MiR-200在肾癌中也是通过ZEB1起到了EMT作用，从而促使其癌细胞的侵袭，通过检测，MiR-200组ZEB1蛋白表达下降，而在E-cadberin蛋白表达上升，并且在相关性检验中，MiR-200的表达与E-cadberin成正相关而与ZEB1成负相关（r=-0.762），说明MiR-200可以抑制ZEB1的表达从而提高E-cadberin的表达，MiR-200的含量越低E-cadberin的含量也越低，细胞的侵袭能力也越强。这些结果都和相关其他研究得到了类似的研究结果，目前研究中，都证实MiR-200与E-cadberin表达具有关联，其研究计算相关系数为r= 0.736，该研究根据数据得知其具有正相关关系（r= 0.824），而存在于中间变量即为ZEB1的表达，ZEB1的表达在这中间起到了桥梁的作用，这些都有助于鉴定未来有意义的治疗靶向，为抑制肾癌转移提供科学依据。

综上所述，随着对microRNA的研究机制越来越系统化和科学化，人们对其的认识也会越来越多，目前很多学者正在研究使用药物抑制肿瘤增生纤维化，从而抑制肿瘤细胞侵袭和转移，而miRNA在肿瘤中扮演着重要的作用，因此如何在MiR-200在肿瘤中低表达的水平得到补充，补充的MiR-200是否也可以抑制肿瘤细胞的转移和侵袭，需要进一步的体内研究实验才能证实，该研究立足于肾癌机制研究，将有助于了解肾癌细胞侵袭转移的过程，为未来研究提供了理论基础。

［参考文献］

［1］Beyer TA，Narimatsu M，Weiss A，et al. The TGFbeta superfamily in stem cell biology and early mammalian embryonic development［J］. BiochimBiophysActa，2013，1830（2）：2268-2279.

［3］那彦群，孙光，叶章群，等.2014版中国泌尿外科疾病诊断治疗指南［Z］.北京：人民卫生出版社，2013.

［4］Li M，Krishnaveni MS，Li C，et al. Epithelium -specific deletion of TGF-beta receptor type II protects mice from bleomycin -induced pulmonary fibrosis［J］. J Clin Invest，2011，121（1）：277-287.

［6］Honeyman L，Bazett M，Tomko TG，et al. MicroRNA profiling implicates the insulin -like growth factor pathway in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice［J］. Fibrogenesis Tissue Repair，2013，6（1）：16.

［7］Abdel A M，Wassef M A，Ahmed H H，et al. The role of bone marrow derived-mesenchymal stem cells in attenuation of kidney function in rats with diabetic nephropathy［J］. DiabetolMetab Syndr，2014，6（1）：34.

［8］Pieraccioli，M，Imbastari，F，Antonov，A，et al.Activation of miR200 by c-Myb depends on ZEB1 expression and miR200 promoter methylation［J］.Cell cycle，2013，12（14）：2351-2359.

Correlation Analysis of Effect of MiR200 on Renal Carcinoma Cell Fibrosis

SHI Ying1，LIN Ling1，KAN Jia-yin1，LIU Hai-yan2，MA Zeng-wei1，LI Shuang-yu1
1.Department of Nephrology，Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical School，Qiqihar，Heilongjiang Province，161000 China；2.Micro Morphology Experimental Center，Institute of Pathology of Qiqihar Medical School，Qiqihar，Heilongjiang Province，161000 China

［Abstract］Objective To research the effect mechanism of MiR200 on renal carcinoma cell fibrosis and provide theoretical basis for identification and treatment of target. Methods The data of 51 cases of patients with renal carcinoma treated in the central laboratory of Qiqihar medical school were selected，the renal cell carcinoma strain model was built，the adjacent normal tissue was used for contrast，the target gene and protein expression was detected by cell invasiveness experiment and Westermblot method，and the correlation between the invasion ability of renal carcinoma cell of MiR-200 and ZEB1，E-cadberin and MiR-200 was analyzed. Results The difference in the average penetrating cell number of SN12-PM6 and 786-0 in the MiR-200 group had statistical significance，P＜0.05，the ZEB1 protein expression in the MiR-200 group decreased，but the E-cadberin protein expression in the MiR-200 group increased，and the correlation coefficient comparison showed that the miR-200 expression was positively correlated with E-cadberin，（r=0.824）but was negatively correlated with ZEB1，（r=-0.762）. Conclusion MiR-200 can adjust the invasion of sebum fibrosis and reduce the ZEB1 protein expression thus increasing the E-cadberin protein expression.

［Key words］MiR200；Renal carcinoma cell；ZEB1；E-cadberin

［中图分类号］R737.11

［文献标识码］A

［文章编号］1674-0742（2016）05（b）-0084-02

DOI：10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.14.084

［基金项目］齐齐哈尔市科学技术计划项目任务（FSGG201422）。

［作者简介］施莹（1975.6-），女，本科，副主任医师，研究方向：肾脏疾病。

收稿日期：（2016-02-17）