活络骨康丸对兔激素性股骨头坏死TNF-α、AKP表达的影响

王晓云，王爱国.河南中医药大学，河南郑州　45005；.郑州市骨科医院，河南郑州　45005



活络骨康丸对兔激素性股骨头坏死TNF-α、AKP表达的影响

王晓云1，王爱国2
1.河南中医药大学，河南郑州450052；2.郑州市骨科医院，河南郑州450052

［摘要］目的通过给已经激素造成股骨头坏死的兔子喂食该院的活络骨康丸，然后取血清测量其中TNF-α、AKP的变化，来探索活络骨康丸治疗机制。方法2015年3月—2016年3月，36只新西兰兔随机分为正常组10只与模型组26只，应用甲强龙联合马血清制造股骨头坏死模型。测量兔子血清中TNF-α、AKP；造模成功后随机分组，模型实验组（9只）在普通饲料基础上加活络骨康丸进行干预，对空白组（9只）和模型对照组（9只）普通饲料喂养，并于不同时间点检验血清相关因子。结果①给活络骨康丸前血清TNF-α、AKP含量比较：模型对照组（3.24±0.29；38.04±3.25）和模型实验组（3.30±0.42；37.90±4.19）较之空白对照组（1.62±0.42；27.81±2.86）TNF-α、AKP水平都显著性增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型实验组（3.30±0.42；37.90±4.19）与模型对照组（3.24±0.29；38.04±3.25）差异无统计学意义（P＞0.05）。②给活络骨康丸后血清TNF-α、AKP含量比较：各组血清中TNF-α、AKP的含量比较：模型对照组（3.16±0.25；37.51±3.91）和模型实验组（2.17±0.64；28.94±4.89）较之空白对照组（1.85±0.68；27.94±3.65）有显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；实验组中血清TNF-α、AKP的量明显低于对照组，并且两者的差异具统计学意义（P＜0.05）。结论活络骨康丸有效干预激素性股骨头坏死兔模型血清中TNF-α、AKP增加，提示活络骨康丸影响股骨头坏死过程及提高成骨细胞活性，促进骨生长，从而起到抑制激素性股骨头缺血性坏死进一步发展的治疗作用。

［关键词］活络骨康丸；股骨头坏死；TNF-a；AKP

激素性股骨头坏死（steroid -inducednecrosis of femoral head，SNFH）是股骨头缺血性坏死常见的一种。郑州市骨科医院纯中药制剂活络骨康丸方组成：当归、丹参、黄芪、鸡血藤，川芎、续断、骨碎补、土鳖虫、乳香、没药、何首乌、鹿角胶、熟地黄、砂仁、地龙等。（规格：每瓶60 g，生产批号20080313，有郑州市骨科医院制剂室加工成丸），本方针对于激素性股骨头坏死（steroid-induced avascular necrosisof femoral head，SANFH），在临床上疗效突出，效果满意。该实验自2015年3月—2016 年3月，选取36只新西兰兔随机分为正常组10只与模型组26只，模型组运用改进马血清联合甲强龙造模法［1］，建立激素性股骨头坏死模型（造模过程死亡7只），检测相关指标鉴定模型（正常组和造模组各处死一只进行鉴定）。造模成功后随机分组，模型实验组（9只）在普通饲料基础上加活络骨康丸进行干预，对空白组（9只）和模型对照组（9只）普通饲料喂养，并于不同时间点检验血清相关因子，旨在探讨TNF-α、AKP水平升高是否对激素性股骨头缺血坏死起到促进作用以及活络骨康丸治疗激素性股骨头缺血性坏死（SANFH）的作用机制。

1　实验内容

1.1实验动物

2015年3月—2016年3月，健康成年新西兰兔36只（符合国际动物保护公约），普通级，体重1.7～2.5 kg，由郑州大学医学院实验动物中心提供（合格证编号：2007001102163）。实验兔饲养于河南中医学院动物实验中心（实验动物伦理审查批准编号：DWLL201409005）。实验饲养环境恒温恒湿，温度（22±2）°C，相对湿度为55±5％，伺料为标准专用兔饲料，适应性喂养2周。

1.2主要药品、试剂及仪器

主要实验用药活络骨康丸（郑州市骨科医院药剂科提供）、马血清（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；甲基强的松龙（辉瑞制药有限公司）；青霉素钠（润泽制药（苏州）有限公司）。

实验器材：3K30低温高速离心机（德国SIGMA）；电子天平（郑州晶誉天平设备公司）；全自动生物组织脱水机（LEICA ST5020）；全自动生物组织包埋机（LEICA EG 1150 H）；全自动切片机（LEICA RM2245）；全自动显微镜（Olympus DP72 BX61）；主要试剂：YD-B（金华市益迪医疗设备厂）TNF-α检测试剂盒（上海酶联生物技术有限公司）、AKP检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）。

1.3试验方法

1.3.1实验兔分组将36只实验用新西兰兔分为两组（按随机数字表法）：正常组10只、造模组26只。给予造模，在造模中致实验兔死亡7只。造模后随机性选取正常组兔1只，造模组兔1只，麻醉后处死，行造模鉴定。造模鉴定成功，按随机数字表法分剩余造模兔18只为两组：造模对照组9只、实验组9只。

运用实验电子秤称取兔固定箱重量W。将兔固定于兔固定箱内，称取两者重量M，以后者M值减去前者W值即为实验兔单只重量。实验造模组兔注射马血清、甲强龙、青霉素等操作、正常组兔生理盐水注射为科学行造模鉴定，正常组兔行与造模组兔同等计量的生理盐水注射。步骤同上。

1.3.2实验兔造模鉴定给药干预造模完后，随机选取正常组兔1只，模型组兔1只，参考王伟［1］的方法进行造模的鉴定并记录：光镜下观察骨、骨髓组织、骨小梁、髓内脂肪组织等的变化并行比较，以骨小梁中正常骨细胞的数量减少，骨陷窝内骨细胞消失，空骨陷窝数明显增多［1］，并行X光摄片比较［2］，以判定造模的成功。

表1　正常组及造模组兔股骨头造模鉴定大体形态

图1　正常对照组造模组

图2　

图3　

实验兔给药干预：通过鉴定模型判定造模成功后，将模型组随机平分两组各9只造模兔，一组为模型实验组，一组为模型对照组。活络骨康丸研末，模型实验组每日按1.5 g/（kg·d）给予活络骨康丸药物，研末均匀混拌于兔饲料中。模型对照组和空白对照组同时同步予以常规饲料饲养。

1.3.3血清采集分别于用药干预前和用药4周后，对3组实验动物行禁食8 h处理，保证自由饮水，实验动物以10％水合氯酸4 mL/kg行腹腔注射进行麻醉，取约8 mL腹主动脉血，室温静置1 h后，离心（3 000 r/min，15 min）取上清液，微量移液枪采缓慢吸出分装［2］。存置-20℃冰箱待测。送实验室测TNF-α、AKP值。

2　实验结果

2.1兔股骨头造模X线比较

随机选取1只正常对照组实验兔股骨头，X线具备完整结构形态，清晰的关节面，均匀的骨密度；随机选取的1只造模组实验兔股骨头X线显现模糊的关节面，骨质结构不清楚，骨质密度亦不均匀。如图1。

2.2正常组及造模组兔股骨头造模鉴定大体形态见表1。

3　实验兔血清TNF-α、AKP含量比较

酶标仪在波长450 nm测定吸光值（OD），测定吸光值后在Excel工作表中，以标准品浓度作纵坐标，对应OD值作横坐标，绘制出标准品线性回归标准曲线（准确性R≥0.99），并从标准曲线可得到待测TNF-α、IL-6的实际蛋白含量（pg/mL）。

3.1ELISA标准曲线

如图2、图3。

3.2实验兔血清TNF-α、AKP含量比较

分析表2可知，各组血清中TNF-α、AKP的含量比较：模型对照组和实验组较之空白对照组都显著性增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；实验组与模型对照的差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2　各组实验兔在造模后、给药前TNF-α、AKP的蛋白含量（±s）

表2　各组实验兔在造模后、给药前TNF-α、AKP的蛋白含量（±s）

注：△与空白对照组比较，P＜0.05。

组别　蛋白含量TNF-α（ug/mL）　AKP（U/mL）空白对照组（n=9）模型对照组（n=9）实验组（n=9）1.62±0.42 （3.24±0.29）△（3.30±0.24）△27.81±2.86 （38.04±3.25）△（37.90±4.19）△

分析表3可知，各组血清中TNF-α、AKP的含量比较：模型对照组和实验组较之空白对照组有显著增高，具有统计学意义（P＜0.05）；实验组较之模型对照组的差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3　各组实验兔实验结束TNF-α、AKP的蛋白含量（±s）

表3　各组实验兔实验结束TNF-α、AKP的蛋白含量（±s）

注：△与空白对照组比较，P＜0.05。

组别　蛋白含量TNF-α（ug/mL）　AKP（U/mL）空白对照组（n=9）模型对照组（n=9）实验组（n=9）1.85±0.68 （3.16±0.25）△2.17±0.64 27.94±3.65 （37.51±3.91）△28.94±4.89

3　讨论

活络骨康丸是郑州市骨科医院针对中早期股骨头坏死的临床常用自制剂，临床应用以来疗效确切，效果满意，价格低廉。全方由当归、丹参、黄芪、鸡血藤、川芎、土鳖虫、骨碎补、乳香、没药、何首乌、鹿角胶、熟地黄、砂仁、地龙等13味中药组成，临床具有集破淤血、通经络，行气止痛、壮筋骨作用，现代医学研究证明，本方可以有效降低血小板粘附及改善毛细血管通透性，同时还具有降低血脂的作用，可以有效降低股骨头坏死发病过程中产生的炎症反应［3-4］可以治疗股骨头坏死。

该实验通过给活络骨康丸前血清TNF-α、AKP含量比较：模型对照组（3.24±0.29；38.04±3.25）和模型实验组（3.30±0.42；37.90±4.19）较之空白对照组（1.62± 0.42；27.81±2.86）TNF-α、AKP水平都显著性增高；给活络骨康丸后血清TNF-α、AKP含量比较：模型对照组（3.16±0.25；37.51±3.91）和模型实验组（2.17±0.64；28.94±4.89）较之空白对照组（1.85±0.68；27.94±3.65）有显著增高。由此可知：①TNF-α、AKP的升高可能对激素性股骨头坏死的形成起到重要作用；②该院制剂活络骨康丸可能通过降低TNF-α、AKP水平从而对激素性股骨头坏死起到治疗作用。

TNF-α、AKP水平的升高在诱发激素性股骨头坏死出现的发病机制可能为：①激素诱导下，TNF-α、AKP水平升高，破坏股骨头内皮细胞，从而出现血管内凝血障碍，以致影响股骨头的血液供应［5］；②TNF-α、AKP水平升高可以刺激软骨细胞和滑膜细胞合成胶原酶酶及PGE-2［6-7］，从而造成关节的破坏；③通过刺激骨吸收作用，从而引起骨与软骨的吸收破坏，导致成纤维细胞的增生，并诱发破骨细胞的增加［8］；④TNF-α、AKP水平升高可以诱导自由基的产生和脂质过氧化，从而导致股骨头细胞破坏，出现股骨头缺血坏死［9］。

综上所述，活络骨康丸是以激素性股骨头坏死的病理机制为出发点，通过调节TNF-α、AKP水平，改善微循环障碍，抑制炎症的发生，促进死骨的修复和新骨的生成，起到缓解关节疼痛，改善髋关节功能障碍的作用，阻止或逆转激素性股骨头坏死的病程进展。

该实验仅初步探索郑州市骨科医院纯中药制剂活络骨康丸治疗激素性缺血性股骨头坏死的作用机制，但是针对本方剂如何导致TNF-α、AKP水平降低的确切机制有待进一步研究和发现。

［参考文献］

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［8］于雪峰，陈凯云，吕岫华，等.基于中医“治未病”理论探讨骨蚀灵胶囊预防激素性股骨坏死的实验研究［J］.中国中医药科技，2014，21（4）：369-371.

［9］崔宏勋，郭珈宜，郭马珑，等.名老中医郭艳锦中医整体疗法治疗股骨头坏死的经验总结叽［J］.中国中医药科技，2014 （z2）：41-42.

Effect of Huoluogukang Pill on TNF-a and AKP Expressions in Rabbits with Steroid-induced Osteonecrosis

WA NG Xiao-yun1，WANG Ai-guo2
1. Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou，Henan Province，450052 China；2. Zhengzhou Orthopaedic Hospital，Zhengzhou，Henan Province，450052 China

［Abstract］Objective To explore the treatment mechanism of huoluogukang pill by feeding huoluogukang pill of our hospital to the rabbits with steroid-induced osteonecrosis caused by hormone and then the serum was taken out for measuring the changes of TNF-α and AKP. Methods 36 New Zealand rabbits were randomly divided into the normal group with 10 and model group with 26 from March 2015 to March 2016，and the osteonecrosis model was made of methylprednisolone and horse serum，the serum TNF-α and AKP of rabbits were measured；and the rabbits were randomly divided into groups after the model was made successfully，the model experimental group（9）were given huoluogukang pill for intervention on the basis of the normal feed，the blank group（9）and model control group（9）fed on normal feed，and the serum correlation factor was tested at the different time points. Results（1）Before giving huoluogukang pill，the TNF-α and AKP levels in the model control group and the model experimental group obviously increased compared with those in the blank control group，and the differences had statistical significance，［（3.24±0.29；38.04±3.25），（30±0.42；37.90±4.19）vs（1.62±0.42；27.81±2.86）］，P＜

0.05；but the differences in the TNF-α and AKP levels between the model control group and the model experimental group were not big without statistical significance，P＞0.05.（2）After giving huoluogukang pill，the TNF-α and AKP levels in the model control group and the model experimental group obviously increased compared with those in the blank control group，and the differences had statistical significance，［（3.16±0.25；37.51±3.91），（2.17±0.64；28.94±4.89）vs（1.85±0.68；27.94± 3.65）］，P＜0.05；the serum TNF-α and AKP levels in the experimental group were obviously lower than those in the control group，and the differences had statistical significance，P＜0.05. Conclusion The serum TNF-α and AKP in rabbit models with steroid-induced osteonecrosis increase after the effective intervention of huoluogukang pill，which reminds that the huoluogukang pill can influence the process of osteonecrosis，improve activity of osteoblast and promote bone growth thus inhabiting the further development of steroid-induced avascular necrosis of the femoral head.

［Key words］Huoluogukang pill；Osteonecrosis；TNF-a；AKP

［中图分类号］R681

［文献标识码］A

［文章编号］1674-0742（2016）05（b）-0086-05

DOI：10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.14.086

［作者简介］王晓云（1980-），男，河南滑县人，在读硕士，主治医师，主要从事中医骨伤病的研究和防治工作。

收稿日期：（2016-02-20）