雌激素灌胃法制备豚鼠子宫肌瘤模型

张玥晗, 文 静, 朱海桃, 赵光宗, 李晓愚(重庆医科大学. 0级临床一系; . 0级临床二系; . 实验教学管理中心, 重庆 40)



雌激素灌胃法制备豚鼠子宫肌瘤模型

张玥晗1, 文 静1, 朱海桃1, 赵光宗2, 李晓愚3
(重庆医科大学1. 2012级临床一系; 2. 2013级临床二系; 3. 实验教学管理中心, 重庆 401331)

[摘要]目的 用雌激素灌胃法制备豚鼠子宫肌瘤模型, 探讨不同剂量及给药周期对子宫肌瘤形成的影响。方法 性成熟雌性豚鼠分为短周期组和长周期组，分别每周2次灌胃戊酸雌二醇(补佳乐)0.1 mg/100 g体质量6周和8周。空白对照组灌胃相同体积生理盐水。灌胃结束后，ELISA法测定血清中雌二醇及孕酮水平; 计算肌瘤形成率、子宫脏器系数; 子宫组织制作石蜡切片，检测子宫肌瘤模型是否成功建立。结果 短周期模型组成瘤率30%，长周期模型组成瘤率40%，总体成瘤率35%。血清学检测显示模型组动物血清雌激素水平明显增高，孕激素水平下降; 病理组织学检测证实造模成功。 结论 雌激素灌胃法是一种简单有效的豚鼠子宫肌瘤模型造模方法。

[关键词]子宫肌瘤; 豚鼠; 雌激素; 灌胃法

子宫肌瘤是女性生殖系统中最常见的良性肿瘤，约占女性所有良性肿瘤的51.87%，育龄期妇女高发，其发病率可高达77%，且呈逐年上升趋势, 严重危害女性身体健康[1,2]。子宫肌瘤的发生、发展与体内性激素关系密切，但目前该病的病因和发病机制尚未完全阐明。建立子宫肌瘤动物模型是研究其发病机制和筛选治疗药物的常用手段。国外多采用自发子宫肌瘤的Eker大鼠模型，成瘤率高但价格昂贵[3]; 此外还有利用基因工程技术构建的转基因小鼠模型、在免疫缺陷动物体内移植人类子宫肌瘤组织建立的异种移植动物模型等[4,5]。这些方法各有优势, 但操作复杂, 对实验室及其配套设备要求较高。国内多采用外源性性激素注射法建立子宫肌瘤模型，包括单一雌激素诱导法(单模法)[6]、雌激素孕激素联合诱导法(双模法)[7]、去势后雌激素诱导法[8]等。用于外源性性激素注射的国内产品有苯甲酸雌二醇注射液和戊酸雌二醇注射液，但近年来该产品陆续停产，难以购买，临床上也已广泛采用雌激素口服制剂进行相关疾病的治疗。近年有些研究项目组改用兽用雌激素注射液进行子宫动物模型建立，结果成瘤率低，造模效果不好[9]。为适应国内目前实验条件，需建立一种简便易行、行之有效的子宫肌瘤模型建模方法，本文探讨用目前临床上常用的口服雌激素药物戊酸雌二醇，采用灌胃法建立豚鼠子宫肌瘤模型，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

清洁级雌性豚鼠 40 只, 重庆医科大学实验动物中心提供[SCXK-(渝)2012-0001]，体质量400± 20 g, 未经生育交配。饲养条件: 室温22±2 ℃, 相对湿度 50%～70%, 自然通风, 光照12 h, 黑暗12 h,每笼5只。以清洁级豚鼠饲料和净化水饲养, 自由摄食和饮水，每日每只豚鼠给予100 g卷心菜补充维生素C。实验前，动物先适应性饲养1周[SYXK-(渝)2012-0001]。

1.2 材料和仪器

戊酸雌二醇(商品名: 补佳乐, Delpharm Lille S.A.S生产，国药准字20130009)，建模剂量参考Fujii 等[10]的方法，计算出每只豚鼠所需补佳乐剂量，将药物研磨至粉状后溶于无菌生理盐水，配置终浓度为0.1 mg/mL，在振荡器上充分震荡混匀后制成混悬液备用。检测雌二醇(E2)和孕酮(P)的ELISA试剂盒购自厦门慧嘉生物科技有限公司。酶标仪(南京华东电子); 组织切片机(杭州科迪); 生物组织脱水机(中威TSJ-SD)。

1.3 方法

1.3.1 造模 将40只豚鼠随机分为4 组, 每组10只。短周期和长周期模型组，每只豚鼠分别按体质量100 g灌胃戊酸雌二醇悬浊液1 mL，每周2次，连续6周和8周; 同时设短周期和长周期对照组，同法灌胃等量生理盐水。

1.3.2 检测项目 短周期模型组和对照组豚鼠6周后处死, 长周期模型组和对照组豚鼠8周后处死。处死前所有豚鼠于眶动脉取血1 mL, 3 000 r/min离心10 min 分离血清, ELISA法测定血清E2和P含量。

处死后豚鼠立即称重，然后解剖观察子宫与肌瘤形态。将子宫完整剪下并称重，计算肌瘤形成率和子宫脏器系数 (子宫重量/体质量×100%)。子宫组织用体积分数10%甲醛固定48 h，石蜡包埋切片，HE染色，显微镜下观察病理组织改变。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 豚鼠子宫肌瘤形成

短周期模型组有3只豚鼠造模成功，肌瘤形成率30%。肉眼可见造模成功豚鼠子宫体积增大、色泽晦暗、肌层增生，个别动物于子宫角处出现肌瘤样结节，1～3个不等。造模期间死亡1只，死亡率10%，死亡原因为肺部感染。长周期模型组造模成功4只，肌瘤形成率为40%。其子宫形态改变较短周期模型组更为明显，体积明显增大、肿胀明显。造模期间死亡3只，死亡率30%，其中2只死于肺部感染，1只死因不明。2组对照组动物子宫体积无增大、质地均匀、无结节或囊肿生长。其中长周期对照组死亡1只，死亡率10%。

2.2 子宫重量和子宫脏器系数

长周期和短周期模型组与相应的对照组比较,子宫重量、子宫脏器指数均明显增加(P<0.05)(表1),说明造模成功。

表1 雌激素对豚鼠子宫重量和脏器系数的影响Table 1 The changes of uterine weight and organ coefficient after estrogen injection

2.3 血清E2、P含量

与相应对照组比较, 模型组血清E2含量均明显增高(P<0.01), 说明造模成功。长周期模型组P含量低于对照组(P<0.05)(表2)。

2.4 病理组织学观察

HE染色显示, 正常豚鼠子宫平滑肌肌层较薄，平滑肌细胞排列整齐，肌纤维细长，流水样排列(图1A)。长周期模型组豚鼠子宫壁增厚，平滑肌细胞增生、增粗、排列紊乱。部分平滑肌细胞互相交错，呈编织样排列，细胞核肥大、深染，增生活跃，病变与人体平滑肌瘤样增生相似(图1B)。

表2 豚鼠血清E2、P含量Table 2 The serum E2 and P levels in guinea pigs

3 讨论

人类疾病动物模型是研究疾病发病机制、临床药物筛选的重要手段，建立适宜的动物模型是人类疾病研究的重要基础。

A: 对照组 B: 模型组图1 豚鼠子宫平滑肌组织学观察(HE×40)A: control group B: model groupFigure 1 Histological observation on uterine smooth muscle in Guinea pig

子宫肌瘤动物模型建立方法多种多样，各有优缺点。Eker大鼠是自发性子宫肌瘤动物模型，其Tsc-2等位基因突变, 导致Tsc-2基因功能缺陷, 从而自发形成包括子宫肌瘤在内的一些良恶性肿瘤[11]。Everitt等[12]报道，雌性未妊娠Eker大鼠自发子宫肌瘤的发生率为65%。转基因小鼠子宫肌瘤模型是通过抑制子宫肌层中SV40 标记基因的表达而建立[13],方法是在转基因小鼠切除卵巢后，每日给予乙烯雌酚(100 mg/kg) 连续15 d后，通过组织病理学观察可见子宫肌层平滑肌细胞增生形成涡旋状肌束，组织形态学上与人类子宫肌瘤相似、并发生雌激素依赖性的子宫肌瘤。子宫肌瘤异种移植动物模型则是在免疫缺陷动物体内移植人源性子宫肌瘤组织而建立，其优点是成瘤率高，肌瘤结构与人类相同。Ishikawa等[14]在非肥胖糖尿病重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠的肾包膜下移植人子宫肌瘤组织，结果正常子宫肌层组织和子宫肌瘤组织的成活率接近100%，且异种移植瘤保留了原组织的组织学特征，是目前成瘤率最高的子宫肌瘤动物模型造模方法。虽然以上方法均可成功建立子宫肌瘤动物模型，但操作方法比较复杂，对实验室条件要求高，费用比较昂贵。

陈海刚等[15]通过给予雌性未妊娠SD 大鼠肌肉注射苯甲酸雌二醇注射液200 mg和300 mg每周2次, 持续8 周和10周, 结果显示200 mg剂量8周组成功建立了与人子宫肌瘤相似的子宫肌瘤模型。邹小丽等[16]给雌性未妊娠SD 大鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/kg, 连续30 d, 每周1 次黄体酮(4 mg/kg), 25～30 d两种激素同时注射，结果显示造模成功。

本研究探讨用目前临床上常用的口服雌激素药物戊酸雌二醇(补佳乐)作为外源性雌激素，通过灌胃的方法建立豚鼠子宫肌瘤动物模型造模。结果表明，0.1 mg/100g体质量剂量下，每周2次口服灌胃，6周即可成功建立子宫肌瘤动物模型，8周成瘤率进一步提高，但动物死亡率上升，且剩余存活动物的一般情况、进食状态和精神状态均变差。两个模型组共20只动物中，建模成功7只，总体成瘤率35%，与文献报道的雌激素注射法成模率(27%～41%)相近[17,18]。血清学检测显示，长、短周期模型组动物E2水平均明显高于对照组，说明补佳乐混悬液能够有效提高动物体内雌激素水平。随着时间延长，孕激素水平逐渐降低，可能与体内性腺轴负反馈抑制有关。与雌激素注射建模法相比，采用雌激素药物灌胃法建立子宫肌瘤动物模型，具有药物来源广泛、建模时间短、经济等优点。李东华等[19]报道，雌孕激素协同造模过程中，初期可能出现大鼠活动减少、精神欠佳、生长缓慢、易激惹甚至出现脱毛、四肢炎性肿块等现象，但本研究中未见类似表现。本研究中出现动物死亡的情况，死因多为肺部感染，是否与灌胃操作不当有关，尚需进一步探讨。此外，由于本研究选用的补佳乐为进口药物，其配方受控保密，无法查到药物填料成分，所以本研究未设立药物填料阴性对照组，药物填料对实验结果的影响还需做进一步研究。

综上，雌激素灌胃建立子宫肌瘤模型，成瘤率与注射法接近，模型豚鼠病理学改变与人平滑肌瘤样增生相似，是一种有效的动物模型造模方法，可用于子宫肌瘤发病机制、治疗方法研究。

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Intragastric Estrogen Administration Induced Guinea Pig Model of Uterine Leiomyoma

ZHANG Yue-han1, WEN Jing1, ZHU Hai-tao1, ZHAO Guang-zong2, LI Xiao-yu3
(1. 2012 No.1 Clinical Department, 2. 2013 No.2 Clinical Department, 3. Experiment Teaching Center, Chongqing Medical University, Chongqing 401331, China)

[Abstract]Objective To establish the guinea pig model of uterine leiomyoma by intragastric administration of estrogen and to discuss the effect of different cycles of administration on formation of uterine leiomyoma. Method Mature female guinea pigs were divided into short term group and long term group, and intragastric administrated with estradiol valerate at 0.1 mg/100 g body weight twice a week for 6 weeks and 8 weeks respectively. The control was intragastric administrated with normal saline with same volume. After 6 or 8 weeks, the guinea pigs were sacrificed. The serum levels of estrogen and progesterone were measured by ELISA and the leiomyoma forming rate was measured. Histological changes were compared between treatment group and control group with HE staining. Results The leiomyoma forming rate in short term group was 30% and long term group was 40%. The average total rate was 35%. The serum level of estrogen in model animals was increased significantly and the progesterone decreased in long term group. Histopathological examination confirmed that the guinea pig model of uterine leiomyoma were established successfully. Conclusions Intragastric estrogen administration was a simple and effective method for establishing uterine leiomyoma guinea pigs model. [Key words] Uterine leiomyoma; Guinea pigs; Estrogen; Intragastric administration

[中图分类号]Q95-33

[文献标识码]A

[文章编号]1674-5817(2016)03-0195-05

doi:10.3969/j.issn.1674-5817.2016.03.007

[收稿日期]2016-01-25

[基金项目]重庆市大学生创新创业计划项目201410631021;重庆医科大学大学生科学研究与创新实验项目201423

[作者简介]张玥晗(1994-), 重庆医科大学2012级临床一系本科生。E-mail: 824025990@qq.com

[通讯作者]李晓愚(1976-), 39岁, 男, 博士研究生、讲师, 主要从事病原生物学研究工作。E-mail: penet@qq.com